5個單細胞組織解離技巧助力實驗效率提升

單細胞組織解離可能會由于組織類型、物種、樣品年齡、處理環(huán)境和其他因素的不同，而變得十分困難，需要在實踐中不斷優(yōu)化以達到最佳的結(jié)果�？的螤柎髮W(xué)博士候選人Madhav Mantri在一次聚焦免疫學(xué)研究的網(wǎng)絡(luò)研討會上分享了他關(guān)于解離小鼠心臟和回腸樣本并用于單細胞基因表達實驗的經(jīng)驗，可以總結(jié)為如下5個Tips：

千錘百“練”

擇善而從

因“材”施策

不妨嘗試連續(xù)酶解

紅細胞清除要趁早

 

01

千錘百“練”

Mantri的研究聚焦病毒性心肌炎，即由感染引起的心臟炎癥。利用1型呼腸病毒感染的新生小鼠模型，他在感染過程中的多個時間點切除小鼠幼鼠的心臟和腸道回腸組織。

“首先，我必須用模擬老鼠，而不是我將要使用的感染病毒的老鼠做大量的練習(xí)，因為我不想把所有的工作放在通過口服灌胃機制感染這些新生幼鼠，然后不使用那些組織進行實驗。所以我用相同年齡的模擬幼崽練習(xí)，它們的組織大小幾乎相同。”

除了使用年齡和組織匹配的模型生物樣本外，Mantri還推薦了在使用珍貴的人體樣本時如何找到可比較的練習(xí)組織。這是生物學(xué)研究中的一個兩難境地：雖然在使用珍貴的人體樣本之前進行練習(xí)是必要的，但由于你所擁有的樣本數(shù)量有限，很難找到真正的人體練習(xí)組織，因為它們十分寶貴。

Mantri建議從文獻入手，確定目標(biāo)組織中的細胞外基質(zhì)（ECM）成分，并了解你所將接觸到的捐贈者或患者的年齡。他建議使用與年齡相適應(yīng)的小鼠組織進行練習(xí)：“找到在哪些年齡的小鼠中你能夠發(fā)現(xiàn)相同的ECM成分，并使用該組織練習(xí)解離。”

ECM構(gòu)成示意圖

此外，人類細胞圖譜聯(lián)盟提供了一個對許多不同的人體組織進行編目的數(shù)據(jù)門戶，包括用于單細胞組織解離的protocol。這是一個有價值的工具，可以與審查這些protocol或執(zhí)行這些protocol的科學(xué)家取得聯(lián)系，因為他們是單細胞實驗中研究這些組織類型的專家。

 

02

擇善而從

Mantri介紹了他的實驗，從組織收集到Ep管，并記錄了樣品處理的最佳做法。首先，因為他使用的是新鮮冷凍單細胞RNA-seq試劑盒，他很早就計劃了實驗，并且對新鮮組織的環(huán)境需求很敏感，以優(yōu)化細胞活力。針對心臟組織，他說：

“我會取出心臟組織，然后把它和冰HBSS溶液一起放在盤子里。然后我會給心臟灌注確保盡可能多地從心室中抽出血液。然后把組織轉(zhuǎn)移到一個新的盤子里，把它切成1毫米見方的小塊。在這期間，組織必須保持在冰冷的溫度，在冰冷洗滌緩沖液中，不應(yīng)該在任何時候進入室溫。”

“我都是在塑料培養(yǎng)皿上完成的，這些培養(yǎng)皿躺在巨大的冰桶上。”

“我把心臟組織放在一個盤子里洗干凈，然后用鑷子把它取出來，放入新鮮的溶液中。我會去除大部分HBSS，讓組織半干。我不會把它浸在很多液體里，而是在盤子的角落放一點HBSS的液體溶液，把我的組織放在那里，然后用刀片在培養(yǎng)皿上切碎。然后我會用移液管把組織和溶液一起吸進去，然后把它轉(zhuǎn)移到一根Ep管上。這就是為什么我不會（在培養(yǎng)皿中）使用大量溶液的原因，因為在開始酶解之前，我使用臺式離心機清洗切碎的碎片。”

對于樣本收集和處理來說，練習(xí)也是必不可少的，正如Mantri強調(diào)的那樣，一些組織比其他更難去除，同時還需保持良好的組織質(zhì)量。例如，動物一被處死，腸道回腸組織就開始消化，這就需要迅速將它們放入冰冷的溶液中。在某些情況下，當(dāng)組織更堅韌時，比如心臟，在動物體內(nèi)更容易灌注它們。

 

03

因“材”施策

酶解是從切碎的組織中釋放單細胞的下一個關(guān)鍵步驟，需要根據(jù)組織和細胞類型選擇恰當(dāng)?shù)拿负蜁r間。根據(jù)Mantri的說法，當(dāng)涉及到酶解組織時，有一個“最佳點”：“你不能花太長時間來解離組織，因為這會影響你的細胞活力。但加入太多酶也不能太快，因為酶反應(yīng)也會在對組織不利的條件下發(fā)生。”

時間序列實驗可以幫助確定在特定的時間反應(yīng)中使用適量的酶：

“對于較低的時間，你使用較高濃度的酶；于較高的時間，使用較低濃度的酶。你可以用酶濃度和時間歷程做一個表。把組織分成不同的試管，然后進行這些反應(yīng)，最后進行細胞計數(shù)，找出你的細胞活力百分比。我一開始是為心臟組織做的，所以我知道我需要至少30分鐘的解離。”

不同酶解離能力

Mantri強調(diào)，尋找解離的最佳點需要特別注意組織的細胞組成。

“解離是一個細胞類型依賴的過程。不同類型的細胞對壓力的耐受性不同。例如，心肌細胞是特定于心臟的細胞類型，必須非常小心地處理，否則你不會得到很好的產(chǎn)量……優(yōu)化肌細胞和平滑肌細胞的解離非常重要，因為它們死得很快。”

Mantri使用了沃辛頓生化公司提供的數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫為酶解作用提供了心臟組織特異性的建議，他強烈推薦給其他人。此外，Mantri建議，如果你想從樣本中研究一種特定的細胞類型，比如干細胞，利用商業(yè)上可用的工具包來解離感興趣的細胞類型是有效的。

然而，當(dāng)相同的組織對酶的需求相互沖突時，解離就會變得更加復(fù)雜。例如，Mantri發(fā)現(xiàn)回腸組織比最初預(yù)期的要復(fù)雜：腸道由完全不同于絨毛的細胞類型組成”，這影響了酶反應(yīng)的效率。此外，腸道組織本身對Mantri在實驗中用于其他組織類型的基本試劑PBS和HBSS的某些成分不耐受。“我們用來破壞（腸道）成纖維細胞基質(zhì)的解離酶不應(yīng)該含有（胰蛋白酶-EDTA）。但它是用來快速去除腸絨毛的。”在這種情況下，EDTA是一把雙刃劍：它能完美地解離絨毛，但抑制了膠原酶的活性，Mantri想用膠原酶來解離腸壁組織，因為膠原酶在溶液中中和了鈣和鎂離子，而鈣和鎂離子是膠原酶發(fā)揮作用所必需的。

Mantri描述了一種解離腸道和絨毛的方法：

“解離壁組織花了一個多小時。但當(dāng)我分兩步做時，把EDTA和絨毛上皮細胞拿出來，把它們放在冰上，把剩下的壁組織塊轉(zhuǎn)移到一個新管子里，把它們徹底洗掉，把EDTA去掉。然后加入膠原酶，補充氯化鈣，然后我發(fā)現(xiàn)可以在20分鐘內(nèi)完成。”

這些創(chuàng)新是從不斷試驗和失敗中總結(jié)出來的。然而，這些經(jīng)驗教訓(xùn)對他和其他人未來的實驗來說是無價的。“有時解離相同的組織可能會對試劑有沖突的要求，所以你必須小心，在你開始下一個反應(yīng)之前，你必須清洗那些以任何方式限制酶反應(yīng)的東西。”

 

04

不妨嘗試連續(xù)酶解

Mantri提供的另一個既能加速解離過程又能確保最佳細胞活力的建議是一種稱為“連續(xù)解離”的方法。“進行連續(xù)解離是一種非常有效的加速解離的方法，但不是通過增加酶的濃度。”Mantri解釋說，他首先將切碎的組織放入2ml的Ep管中，在熱循環(huán)器上以極低的速度混合。他更詳細地描述了這個過程：

“在30分鐘的解離protocol中，每隔10分鐘，我將旋轉(zhuǎn)管下或讓它沉淀，從熱循環(huán)器中取出它，并保持它在壁上穩(wěn)定。我讓大塊的組織沉淀下來，取下懸浮液，把它放在冰上的新管子里。如果有一些細胞脫離了組織，在溶液中，我不希望它們不高興地停留30或40分鐘。我希望他們?nèi)ヒ粋�4℃的快樂的地方。所以我會準(zhǔn)備一個更大的試管，里面有很多溶液，基本上是很多PBS+BSA，你最終要把細胞重新掛起來。然后，我會用新鮮的酶替換酶，以加快整個流程。如果你使用相同的酶30分鐘，酶的活性在解離過程中是不一樣的。如果每隔10分鐘，換3次酶，就能加速下一輪的解離。解離會更有效，你已經(jīng)把懸浮狀態(tài)的細胞取出來，把它們放在PBS BSA溶液中。”

 

05

紅細胞清除要趁早

在單細胞懸浮液形成后，在將單細胞上機之前，還有幾個關(guān)鍵的清潔步驟。清洗細胞懸液是很重要的，以清除不需要的細胞或碎片，特別是任何殘留的紅細胞從組織。Mantri分享了他如何確保干凈的細胞懸液：

“我通常使用紅細胞裂解緩沖液（ACK裂解緩沖液）來清除紅細胞。我想說的一件重要的事情是，如果你要做3到4個洗滌步驟，紅細胞溶解越快越好。當(dāng)紅細胞溶解時，它們會將RNA釋放到溶液中。如果不是50ml的試管，而是15ml的試管，洗掉任何游離的RNA會有很大的不同。如果你洗得不夠干凈，溶液中有自由漂浮的RNA，你把它加載到儀器中，這些RNA分子會在液滴中被編碼，你的數(shù)據(jù)中到處都是背景。”

Mantri強調(diào)，即使在組織分解開始之前，也必須勤奮地進行清洗步驟，以確保在這些階段移除盡可能多的不想要的細胞，就像在紅細胞分解的這一步一樣。

 

以上就是Mantri關(guān)于單細胞實驗組織解離經(jīng)驗分享的全部內(nèi)容，希望對同樣開展單細胞實驗的你有所啟發(fā)和幫助。