恩格列凈在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)傳導(dǎo)中的作用

恩格列凈可減輕內(nèi)皮炎癥并減弱由糖萼破壞引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)傳導(dǎo)
內(nèi)皮糖萼（GCX）是一種富含糖胺聚糖和蛋白聚糖的功能層，分布在內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)其作為機(jī)械傳感器和炎癥細(xì)胞附著的屏障作用促進(jìn)體內(nèi)平衡。GCX在病理狀況（如2型糖尿病（T2D）和動(dòng)脈粥樣硬化）中的破壞導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞（EC）功能障礙，從而導(dǎo)致心血管疾病進(jìn)展。特別是，EC GCX的主要成分硫酸乙酰肝素（HS）的體外和體內(nèi)降解已被證明會(huì)損害剪切力調(diào)節(jié)的一氧化氮（NO）的產(chǎn)生并促進(jìn)炎癥細(xì)胞的粘附。鑒于其在EC穩(wěn)態(tài)中的核心作用，GCX被認(rèn)為是預(yù)防或緩解EC功能障礙的潛在治療靶點(diǎn)，因此有益于臨床結(jié)果。

 

恩格列凈（EMPA）屬于鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-2抑制劑（SGLT2i）類藥物，用于治療T2D和心力衰竭。動(dòng)物研究表明，EMPA對(duì)非糖尿病條件下的動(dòng)脈粥樣硬化、心力衰竭和缺血再灌注損傷具有多效性和擴(kuò)展保護(hù)作用。盡管已經(jīng)提出了心臟和血管保護(hù)機(jī)制，EMPA促進(jìn)EC穩(wěn)態(tài)并進(jìn)而有助于改善血管健康的確切機(jī)制仍有待澄清。

 

在加拿大麥吉爾大學(xué)化學(xué)工程系以及健康中心課題組的一項(xiàng)研究中，考慮到GCX健康在EC功能中的重要性以及EMPA改善心血管預(yù)后的顯著能力，假設(shè)EMPA可以克服由GCX破壞引起的EC功能障礙，這可以部分解釋血管健康的改善。之前已經(jīng)證明，EMPA可以通過(guò)急性降解后恢復(fù)的GCX的剪切力機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)使ECs的炎癥反應(yīng)正�；�。由于GCX是一個(gè)具有再生潛力的動(dòng)態(tài)表層，因此該研究旨在更深入地探索持續(xù)GCX破壞下涉及的信號(hào)通路，以確定EMPA的其他抗炎機(jī)制。

 

 

EMPA 誘導(dǎo)的抗炎反應(yīng)獨(dú)立于 HS

持續(xù)的HS降解用于評(píng)估ECs對(duì)獨(dú)立于HS的EMPA的炎癥反應(yīng)。對(duì)TNF-α處理的細(xì)胞進(jìn)行炎癥細(xì)胞粘附測(cè)定，與對(duì)照組相比，EMPA顯著降低了NB4細(xì)胞粘附（圖1）。雖然持續(xù)降解導(dǎo)致NB4細(xì)胞粘附顯著增加，顯示出增強(qiáng)的炎癥反應(yīng)，但EMPA將粘附降低到與未降解組相同的水平，并低于對(duì)照組。這表明EMPA可防止ECs對(duì)TNF-α刺激和HS降解的炎癥反應(yīng)。由于它在持續(xù)降解下持續(xù)存在，因此可以假設(shè)EMPA可以獨(dú)立于HS減少炎癥。

 

圖1   剪切培養(yǎng)24小時(shí)后的NB4急性早幼粒白血病細(xì)胞粘附測(cè)定

（a）在有或沒(méi)有EMPA處理的持續(xù)HS降解下，NB4細(xì)胞粘附到TNF-α刺激的ECs的相對(duì)數(shù)量。與對(duì)照組相比，降解導(dǎo)致粘附增加。與對(duì)照組相比，EMPA降低了粘附力，并防止了降解引起的增加，導(dǎo)致粘附水平低于對(duì)照組。

（b）每種條件的代表性圖像。

 

ICAM-1 和 eNOS 與 HS 非依賴性 EMPA 抗炎反應(yīng)無(wú)關(guān)

通過(guò)評(píng)估eNOS和ICAM-1的表達(dá)，以表征持續(xù)HS降解誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)及其在EMPA提供的恢復(fù)效果中的潛在作用。培養(yǎng)24小時(shí)后，與TNF-α對(duì)照相比，所有靜態(tài)和剪切TNF-α+ 條件下的eNOS表達(dá)均降低（圖2 a）。未觀察到EMPA和降解對(duì)eNOS表達(dá)的影響。與無(wú)TNF-α的靜態(tài)對(duì)照相比，剪切力（10 dyne/cm2）顯著提高了磷酸化-eNOS 在Ser1177位點(diǎn)的水平（圖2 b）。在所有剪切條件下，TNF-α刺激使剪切力誘導(dǎo)的磷酸化eNOS Ser1177的增加降低到相似水平，表明eNOS活化降低。同樣，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)由EMPA或降解引起的磷酸化eNOS Ser1177的顯著影響。同樣，TNF-α在所有條件下誘導(dǎo)ICAM-1的表達(dá)到相似水平（圖2 c），剪切力、EMPA或降解均無(wú)顯著影響。有趣的是，在剪切條件下，有或沒(méi)有TNF-α的情況下，磷酸化-eNOS Ser1177/總eNOS比率保持不變，而在靜態(tài)培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)的比率顯著更高（圖2 d）。這些結(jié)果表明，eNOS的激活和ICAM-1的表達(dá)與EMPA對(duì)EC功能障礙的HS獨(dú)立恢復(fù)沒(méi)有直接關(guān)系。

 

圖2培養(yǎng)24小時(shí)后通過(guò)蛋白質(zhì)印跡密度測(cè)定進(jìn)行蛋白表達(dá)定量。

評(píng)估（a）eNOS、（b）磷酸化eNOS Ser1177、（c）ICAM-1和（d）磷酸化eNOS/總eNOS的比率的表達(dá)。（e）代表性條帶和培養(yǎng)條件細(xì)節(jié)。

 

由持續(xù)HS降解引起的未折疊蛋白反應(yīng)的誘導(dǎo)部分通過(guò)EMPA恢復(fù)

為了探索HS和EMPA持續(xù)降解影響的可能信號(hào)通路，超越GCX的傳統(tǒng)機(jī)械生物學(xué)和抗炎作用，進(jìn)行了全基因組轉(zhuǎn)錄組分析，試圖更好地了解EMPA防止剪切力培養(yǎng)下HS持續(xù)降解引發(fā)的炎癥反應(yīng)增加的機(jī)制。篩選EC功能障礙相關(guān)基因并分組，根據(jù)其折疊變化確定所涉及的信號(hào)通路。

 

剪切力下（10 dyne/cm2）暴露24 h顯示，與靜態(tài)對(duì)照相比，eNOS（NOS3）、KLF2和COX-2（PTGS2）等標(biāo)志性基因受到調(diào)控，炎癥信號(hào)基因（IL1B、IL6）下調(diào)。剪切力也略微下調(diào)了ICAM-1的mRNA表達(dá)。

 

HS在剪切作用下持續(xù)降解，導(dǎo)致與未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）和C / EBP同源蛋白（CHOP）轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的基因上調(diào)，表明ECs受到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）應(yīng)激的影響。因此，與對(duì)照組相比，激活轉(zhuǎn)錄因子3（ATF3），DNA損傷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄本3（DDIT3）和Tribble同源蛋白3 （TRIB3）在HS降解下顯著上調(diào)（圖3 a）。通過(guò)活化轉(zhuǎn)錄因子4（ATF4）、真核翻譯起始因子2α激酶3（EIF2AK3；PERK），ER伴侶蛋白Grp78（HSPA5）、生長(zhǎng)停滯和DNA損傷誘導(dǎo)蛋白GADD34（PPP1R15A）的上調(diào)，UPR的激活也很明顯（圖3 b）。在HS降解下，EMPA顯著降低了ATF3、DDIT3、HSPA5、PPP1R15A、TRIB3的表達(dá)。持續(xù)HS降解和EMPA誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控似乎主要通過(guò)UPR的PKR樣ER激酶（PERK，EIF2AK3）/真核起始因子2（eIF2）/ATF4分支介導(dǎo)（圖3 c）。這些結(jié)果表明，剪切力下的HS降解通過(guò)激活UPR促進(jìn)EC功能障礙，進(jìn)而激活CHOP介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。EMPA處理可通過(guò)下調(diào)關(guān)鍵UPR基因的轉(zhuǎn)錄水平來(lái)減輕ER應(yīng)激。

 

圖3   持續(xù)HS降解和EMPA處理對(duì)ER應(yīng)激基因轉(zhuǎn)錄的影響

 

EMPA通過(guò)調(diào)節(jié)TXNIP潛在地減輕炎癥

EMPA被發(fā)現(xiàn)可降低影響氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)的硫氧還蛋白相互作用蛋白（TXNIP）的表達(dá)，并與ER應(yīng)激有關(guān)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在靜態(tài)培養(yǎng)物中用EMPA處理6小時(shí)可下調(diào)TXNIP的mRNA表達(dá)。暴露于剪切力24小時(shí)后，TXNIP mRNA水平顯著降低。持續(xù)的HS降解部分消除了剪切了誘導(dǎo)的調(diào)控，用EMPA處理通過(guò)顯著降低降解引起的升高水平使其表達(dá)正�；�。持續(xù)的HS降解也導(dǎo)致TXNIP蛋白表達(dá)顯著增加，與mRNA水平相似，與對(duì)照組相比，EMPA使表達(dá)正�；�。這表明TXNIP可能是ER應(yīng)激反應(yīng)的潛在介質(zhì)，因?yàn)樗�的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)受到剪切，持續(xù)HS降解和EMPA的調(diào)節(jié)。

 

N-Acetyl-L-cysteine處理可降低NB4細(xì)胞粘附

為了進(jìn)一步研究由EMPA引起的NB4細(xì)胞粘附減少，實(shí)驗(yàn)試圖確定這種效應(yīng)是否是通過(guò)調(diào)節(jié)剪切力下的氧化應(yīng)激和HS持續(xù)降解介導(dǎo)的。在粘附測(cè)定之前，ECs在剪切力下暴露24小時(shí)，用N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）處理。與對(duì)照組相比，NAC沒(méi)有顯著減少粘附的NB4細(xì)胞的數(shù)量（圖4）。然而，在持續(xù)降解的情況下，用NAC處理導(dǎo)致粘附顯著降低，與EMPA提供的效果相當(dāng)。這可能表明，剪切力暴露期間氧化應(yīng)激的緩解是EMPA處理的ECs減少其對(duì)HS持續(xù)降解的炎癥反應(yīng)的潛在機(jī)制。

 

圖4    用NACNB4進(jìn)行細(xì)胞粘附測(cè)定以減輕氧化應(yīng)激

（a）在剪切培養(yǎng)下處理和持續(xù)HS降解后，NB4細(xì)胞粘附于TNF-α刺激EC的相對(duì)數(shù)量。

（b） 每種條件的代表性圖像。

 

總之，該研究提出了一種可能的機(jī)制，通過(guò)這種機(jī)制，EMPA可能有助于改善內(nèi)皮健康。研究結(jié)果表明，EMPA具有獨(dú)立于HS介導(dǎo)的功能而減弱EC炎癥的潛力，如HS持續(xù)降解下炎癥細(xì)胞粘附的減少所示。EMPA下調(diào)促凋亡信號(hào)和TXNIP表達(dá)可能有助于減輕氧化應(yīng)激，從而限制ER應(yīng)激下的氧化損傷，并導(dǎo)致炎癥細(xì)胞粘附減少。未來(lái)的研究應(yīng)旨在研究TXNIP通過(guò)NLRP3炎癥小體和凋亡信號(hào)表達(dá)炎癥反應(yīng)的調(diào)控機(jī)制。更好地了解SGLT2i對(duì)GCX介導(dǎo)的EC功能的影響可能有益于在發(fā)現(xiàn)慢性GCX損傷的病理?xiàng)l件下限制EC功能障礙的新策略。

 

參考文獻(xiàn)：Campeau MA, Leask RL. Empagliflozin mitigates endothelial inflammation and attenuates endoplasmic reticulum stress signaling caused by sustained glycocalyx disruption. Sci Rep. 2022 Jul 25;12(1):12681. doi: 10.1038/s41598-022-16763-6. PMID: 35879337; PMCID: PMC9314417.

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35879337/

 

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