細(xì)胞因子在CAR-T治療癌癥中的重要作用

前言
 

CAR-T細(xì)胞療法在血液瘤治療中已被認(rèn)為是最先進(jìn)、最有效的策略之一，然而在實體瘤治療中療效并不顯著。其中一個原因主要是由于抑制性細(xì)胞因子、低氧環(huán)境和活性氧的存在。使腫瘤周圍形成不利于T細(xì)胞的滲透和發(fā)揮作用的腫瘤微環(huán)境。結(jié)合細(xì)胞因子的功能優(yōu)勢，靶向腫瘤細(xì)胞的第四代CAR結(jié)構(gòu)已經(jīng)被開發(fā)出來并額外釋放有助于T細(xì)胞發(fā)揮作用的細(xì)胞因子。在CAR-T細(xì)胞發(fā)揮作用過程中，細(xì)胞因子在免疫細(xì)胞的激活、擴(kuò)增和亞群的極化中起著關(guān)鍵作用。

 

因此本篇文章主要對細(xì)胞因子對CAR-T細(xì)胞功能的影響、在CAR-T生產(chǎn)過程中的應(yīng)用及臨床效果進(jìn)行討論。強(qiáng)調(diào)了細(xì)胞因子在細(xì)胞治療中的重要性。

 

細(xì)胞因子對CAR-T細(xì)胞功能的影響
 

腫瘤是一種復(fù)雜的組織，除含有腫瘤細(xì)胞外，還含有內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞、炎癥細(xì)胞、成纖維細(xì)胞以及非細(xì)胞成分，如細(xì)胞因子、脂類介質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)。在腫瘤微環(huán)境（TME）中，不同的組分能夠通過不同的機(jī)制誘導(dǎo)血管生成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活和增殖，并抑制T細(xì)胞的抗腫瘤反應(yīng)。

 

腫瘤浸潤性炎癥細(xì)胞被腫瘤細(xì)胞分泌到腫瘤微環(huán)境的細(xì)胞因子所吸引，首先，它們通過產(chǎn)生活性氧、分泌促炎細(xì)胞因子和介導(dǎo)細(xì)胞毒作用，構(gòu)成了對抗腫瘤的初始防線。然而，當(dāng)這種促炎環(huán)境與TME的慢性炎癥發(fā)展相平衡時，會導(dǎo)致局部組織微環(huán)境轉(zhuǎn)變?yōu)榇龠M(jìn)腫瘤生長的狀態(tài)。TME細(xì)胞利用細(xì)胞因子的功能，對免疫細(xì)胞的增殖、分化、激活、遷移和存活產(chǎn)生負(fù)面影響，構(gòu)成了一個不利的微環(huán)境。因此，細(xì)胞因子在調(diào)節(jié)抗腫瘤反應(yīng)、細(xì)胞轉(zhuǎn)化和惡性腫瘤的增殖中扮演著重要的角色。

 

1.1   IL-2 and TGF-β

 

TGF-β主要由腫瘤微環(huán)境中兩種免疫抑制細(xì)胞即髓系來源的抑制細(xì)胞(MDSCs)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)分泌，誘導(dǎo)促腫瘤反應(yīng)。Tregs(CD25+Foxp3+)一方面通過分泌TGF-β影響T細(xì)胞活性。另一方面通過募集IL-2限制腫瘤微環(huán)境中效應(yīng)性T細(xì)胞的擴(kuò)增。在體內(nèi)，TGF-β通過抑制穿孔素、顆粒酶和干擾素-γ的表達(dá)等多種機(jī)制，使CD8+和CD4+T細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒T細(xì)胞活性的下調(diào)。因此抑制TGF-β在免疫微環(huán)境中的抑制作用，對CAR-T細(xì)胞發(fā)揮高效作用具有重要意義。目前溶瘤腺病毒表達(dá)TGF-β受體II-Fc融合蛋白與CAR-T聯(lián)合治療乳腺癌模型中已展現(xiàn)加強(qiáng)抗腫瘤效果。

 

1.2   IL-6

 

IL-6被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的重要細(xì)胞因子。研究表明，不同類型癌癥(如黑色素瘤、結(jié)直腸癌等)患者血清中的IL-6濃度過高與患者的預(yù)后不良有關(guān)。一項研究表明，shRNA-IL-6基因敲除的ssCART-19細(xì)胞在注入小鼠體內(nèi)后，導(dǎo)致IFN -γ、TNF、IL-2和IL-17A細(xì)胞因子水平升高，而IL-10和IL-6水平下降，對抑制荷瘤小鼠有明顯的增強(qiáng)效果。但在4周后會在大部分組織器官中出現(xiàn)，因此，說明shRNA-IL-6基因敲除的ssCART-19延長了荷瘤小鼠的存活時間，但具有潛在的免疫毒性。因此，更好地了解和利用細(xì)胞因子在腫瘤的生物發(fā)生中的作用，對提高CAR-T細(xì)胞的治療效果，變得越來越重要。

 

1.3   IFN-γ

 

干擾素-ℽ是一種有效的促炎劑，除了刺激促炎巨噬細(xì)胞和誘導(dǎo)Treg細(xì)胞凋亡外，它還對腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞抑制、抗增殖和促凋亡作用，在細(xì)胞免疫和抗腫瘤反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。干擾素-ℽ的主要來源是天然免疫細(xì)胞、NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞以及獲得性免疫細(xì)胞、CD4+和CD8+T細(xì)胞。IFN-γ除具有抗腫瘤作用，也可以幫助腫瘤逃脫免疫監(jiān)視，據(jù)報道肝癌、乳腺癌和黑色素瘤模型表明，長期低劑量干擾素ℽ可導(dǎo)致腫瘤生長，并誘導(dǎo)與T細(xì)胞活性障礙有關(guān)的分子PD-L1、PD-L2、CTLA-4和Foxp3的表達(dá)。結(jié)合IFN-γ的作用，文獻(xiàn)報道了IL-6/IFN-γ雙敲除CAR-T細(xì)胞在體外可減少PBMC釋放多種細(xì)胞因子，為臨床應(yīng)用提供了一種有希望的策略。

 

細(xì)胞因子調(diào)動T細(xì)胞實現(xiàn)雙重殺傷
 

最近，帶有啟動T細(xì)胞殺傷的細(xì)胞因子的新一代CAR-T細(xì)胞被開發(fā)出來。這些CAR-T細(xì)胞被修飾細(xì)胞因子生產(chǎn)盒（可誘導(dǎo)的）。將CAR-T細(xì)胞的細(xì)胞毒性與細(xì)胞因子的原位傳遞聯(lián)系起來，增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，繞過腫瘤微環(huán)境，更好的調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)。

 

最初Chmielewski等人設(shè)計了癌胚抗原(CEA)特異性的CAR，并修飾表達(dá)IL-12分別在體外和體內(nèi)模型中驗證，結(jié)果表明CAR-T細(xì)胞分泌IL-12后產(chǎn)生更大的炎癥反應(yīng)，提高T細(xì)胞的激活，并招募額外的免疫細(xì)胞，如抗腫瘤巨噬細(xì)胞到腫瘤微環(huán)境，顯著提高抗腫瘤反應(yīng)。

 

同時，在具有高度免疫抑制腫瘤環(huán)境的卵巢癌中，Koneru等發(fā)現(xiàn)，CAR-T細(xì)胞經(jīng)修飾表達(dá)IL-12后在體外能更好的抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖并且干擾素-γ的分泌增加。在體內(nèi)注射后，小鼠存活率明顯提升，干擾素-γ分泌增加，顯示出更強(qiáng)的抗腫瘤效果。

 

此外CAR-T細(xì)胞修飾表達(dá)IL-7、IL-15、IL-18、IL-22和IL-23等細(xì)胞因子也在研究當(dāng)中，以及多種細(xì)胞因子共表達(dá)目前也備受關(guān)注。巴特拉等在肝癌模型中分別以及聯(lián)合檢測CAR-T細(xì)胞修飾表達(dá)細(xì)胞因子IL-15和IL-21的效果。結(jié)果表明，共表達(dá)IL-15和IL-21的CAR-T細(xì)胞可以有效的對抗腫瘤細(xì)胞。聯(lián)合表達(dá)也表現(xiàn)出使CAR-T細(xì)胞維持長的存活時間，并且可以維持T細(xì)胞因子-1 (TCF-1)的表達(dá)，促進(jìn)T細(xì)胞發(fā)育和存活。總體而言，CAR-T細(xì)胞中融合表達(dá)細(xì)胞因子會調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，招募免疫系統(tǒng)中的其他免疫細(xì)胞，促進(jìn)CAR-T細(xì)胞具有更好的持久性和有效性。

 

細(xì)胞因子在CAR-T細(xì)胞制造過程中的作用
 

CAR-T細(xì)胞制造平臺包括四個步驟，細(xì)胞因子在最終產(chǎn)品的質(zhì)量和功能中起著核心作用。1. T細(xì)胞的分離和富集。CD3+T細(xì)胞通常從外周血單個核細(xì)胞(PBMC)中獲得或者從白細(xì)胞分離中獲得，并通過淋巴細(xì)胞分離液離心法進(jìn)一步分離。2.具體亞型T細(xì)胞富集。使用諸如CD3+、CD4+、CD8+、CD25+的磁珠來實現(xiàn)對特定T細(xì)胞亞群的富集，也可通過選擇或去除PBMC內(nèi)的特定T細(xì)胞類型，使特定T細(xì)胞擴(kuò)增，并以固定的CD4：CD8比率得到最終的細(xì)胞產(chǎn)物。3. 基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。通常是通過病毒載體將相應(yīng)的遺傳信息轉(zhuǎn)移到T細(xì)胞，介導(dǎo)T細(xì)胞表面CAR的表達(dá)�；�于病毒的基因傳遞系統(tǒng)是常用的基因傳遞系統(tǒng)，它們可以達(dá)到很高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。4.擴(kuò)增CAR-T細(xì)胞。通過體內(nèi)培養(yǎng)方法擴(kuò)增，最后的細(xì)胞產(chǎn)品經(jīng)過工藝末期配方并進(jìn)行超低溫保存。

 

細(xì)胞因子對生產(chǎn)CAR-T細(xì)胞的T細(xì)胞的激活、擴(kuò)增和質(zhì)量控制起著重要作用。富集的T細(xì)胞在特定的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，通常添加IL-2、IL-7、IL-15和IL-21等重要的細(xì)胞因子，最常用的兩種CAR-T細(xì)胞產(chǎn)生策略是基于IL-2或IL-7細(xì)胞因子。正如上文所提到的，IL-2通過上調(diào)穿孔素、顆粒酶B和干擾素-γ促進(jìn)終末效應(yīng)T細(xì)胞的增殖和分化，并抑制記憶細(xì)胞marker BCL6和IL7RA的表達(dá)。因此，IL-2對T細(xì)胞培養(yǎng)尤為重要。然而，IL-2也會促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）的擴(kuò)張，從而抑制CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤活性。因此IL-2加入的劑要加以摸索。

 

此外，IL-7、IL-15和IL-21的加入可以減少CAR-T細(xì)胞的終末分化，增加記憶干細(xì)胞的數(shù)量，提高體內(nèi)持久性。據(jù)報道，單獨(dú)補(bǔ)充IL-15可以減少耗竭標(biāo)志物的表達(dá)，增加抗凋亡特性，在刺激CAR-T細(xì)胞體外擴(kuò)增、持續(xù)存活和腫瘤殺傷方面表現(xiàn)出類似的效果。IL-7/IL-15加入增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞的激活并產(chǎn)生較少的耗竭marker。CAR-T細(xì)胞中加入IL-2或者IL-15會產(chǎn)生更多的促炎因子，在體外表現(xiàn)出較強(qiáng)的腫瘤溶解能力�？傊�，CAR-T細(xì)胞在離體的生產(chǎn)過程中，必須加入特定的細(xì)胞因子，目前的研究主要集中于IL-2、IL-7、IL-15和IL-2，但最佳的細(xì)胞因子組成以及在CAR-T細(xì)胞生成過程中是否加入其他細(xì)胞因子要根據(jù)患者、腫瘤和臨床情況而定。

 

細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS）
 

CAR-T細(xì)胞的使用被認(rèn)為是一種有效治療腫瘤的方法，但CAR-T細(xì)胞注入后的副作用在臨床中也逐漸表現(xiàn)出來。CRS是目前尚未明確闡明的最突出的副作用,根據(jù)臨床試驗，接受CAR-T治療的患者中高達(dá)90%會出現(xiàn)CRS，一半的患者進(jìn)展到3-4級，甚至導(dǎo)致死亡。

 

出現(xiàn)CRS后，血清細(xì)胞因子水平、炎癥標(biāo)志物普遍升高，同時免疫系統(tǒng)被激活。通常CRS發(fā)生在輸液后第1天至第14天之間，臨床表現(xiàn)可能包括發(fā)熱、肌肉酸痛、乏力，并可能進(jìn)展為缺氧、毛細(xì)血管滲漏、重要器官功能障礙等，但大多數(shù)患者能夠自我抵抗這一反應(yīng)。然而，少數(shù)患者需要使用抗IL-6等進(jìn)行特異性治療。

 

小結(jié)
 

CAR-T細(xì)胞療法已被認(rèn)為是一種突破性的治療方法在血液瘤患者中，然而，在實體瘤中的應(yīng)用仍然有限。然而細(xì)胞因子已經(jīng)被證明與涉及CAR-T細(xì)胞治療的復(fù)雜過程有著重要的聯(lián)系，因此在CAR-T細(xì)胞的基礎(chǔ)上，融合表達(dá)細(xì)胞因子或在CAR-T細(xì)胞生產(chǎn)工藝過程中加入細(xì)胞因子有望突破CAR-T在實體瘤治療中的局限和增強(qiáng)在血液瘤治療中的效果。

 

來源：BIG

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