間歇壓縮力誘導(dǎo)小鼠多能干細(xì)胞擬胚體中的細(xì)胞周期并減少細(xì)胞凋亡

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs），可通過重編程體細(xì)胞（包括口腔組織細(xì)胞）產(chǎn)生，具有無限的自我更新特性，可以分化成任何類型的細(xì)胞和組織。因此，iPSCs被認(rèn)為是一種很有前途的工具，不僅用于組織再生，而且通過體外制造三維（3D）組織/器官（類器官）進(jìn)行疾病建模。

 

機(jī)械應(yīng)力是iPSCs類器官形成的一種有前途的操作技術(shù)。機(jī)械力調(diào)節(jié)干細(xì)胞中的許多生物反應(yīng)。機(jī)械刺激誘導(dǎo)iPSCs向骨和軟骨細(xì)胞譜系分化和成熟。因此，機(jī)械力對干細(xì)胞反應(yīng)的影響在很大程度上取決于與力和細(xì)胞相關(guān)的許多因素，包括力的類型、大小、持續(xù)時(shí)間、細(xì)胞類型和細(xì)胞階段。

 

在口腔科學(xué)領(lǐng)域，間歇性壓縮力（ICF）在與咀嚼、咬合或正畸治療相關(guān)的細(xì)胞行為調(diào)節(jié)方面得到了特別好的研究。ICF調(diào)節(jié)許多信號通路并進(jìn)一步影響各種細(xì)胞反應(yīng)。因此，需要進(jìn)行系統(tǒng)分析來研究ICF如何影響細(xì)胞反應(yīng)。

 

已經(jīng)在各種條件下研究了全局基因表達(dá)譜，以確定機(jī)械力調(diào)節(jié)的潛在途徑。ICF處理的PDLCs在局灶粘附，肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)，TGF-β信號通路和細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體通路中顯示出基因表達(dá)的顯著變化。在這種情況下，開發(fā)有效的再生醫(yī)學(xué)和工程細(xì)胞操作方法需要了解響應(yīng)機(jī)械刺激的全局基因表達(dá)譜，特別是在能夠在體外形成復(fù)雜類器官的iPSCs中。然而，ICF對iPSCs的影響仍然未知。

 

日本東北大學(xué)牙科研究生院、朱拉隆功大學(xué)牙科學(xué)院研究團(tuán)隊(duì)的一項(xiàng)研究旨在通過使用RNA測序進(jìn)行全局基因表達(dá)分析，鑒定3D培養(yǎng)小鼠iPSCs中ICF調(diào)控的途徑。

 

 

ICF處理的iPSCs的差異基因表達(dá)譜

 

將小鼠iPSCs形成的擬胚體進(jìn)行總RNA分離以進(jìn)行高通量RNA測序。ICF（1.5 g·cm^-2，0.23 Hz）處理24小時(shí)后，與未負(fù)荷對照相比，iPSC結(jié)構(gòu)沒有顯著形態(tài)變化。與未負(fù)荷對照相比，ICF在24小時(shí)不影響細(xì)胞活力。ICF處理上調(diào)了893個(gè)基因，下調(diào)了1076個(gè)基因。差異調(diào)控基因在生物過程、細(xì)胞成分和分子功能上分別與代謝過程、膜和蛋白質(zhì)結(jié)合有關(guān)。

 

基于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)BIOGRID功能數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基于網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涞姆治�，豐富生物過程類別中的基因本體。上調(diào)基因的富集基因本體類別與細(xì)胞周期有關(guān)，而下調(diào)基因的富集基因本體類別與小分子和輔助因子代謝過程相關(guān)。

 

ICF 影響 iPSCs 中的 p53 和細(xì)胞周期通路

 

使用KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行的生物信息學(xué)分析揭示了ICF調(diào)控的幾種通路。上調(diào)基因參與p53信號通路和FoxO信號通路，而下調(diào)基因參與HIF-1信號通路。與對照組相比，p53信號通路中的20個(gè)基因（圖1 a）和細(xì)胞周期通路中的11個(gè)基因（圖1 b）在ICF處理中差異表達(dá)。圖1 a所示的20個(gè)差異表達(dá)基因均分布在p53信號通路KEGG數(shù)據(jù)庫的通路圖（map04115）中，表明ICF影響了p53通路的大多數(shù)組，包括細(xì)胞周期（G1停滯）、細(xì)胞凋亡、DNA修復(fù)/損傷預(yù)防和p53負(fù)反饋。Ccnd1與Cdk6形成復(fù)合物以調(diào)節(jié)G1 / S轉(zhuǎn)變，存在于p53信號通路和細(xì)胞周期的熱圖中（圖1 a、b）。細(xì)胞周期蛋白G1（Ccng1）在DNA損傷后上調(diào)，并作為負(fù)反饋系統(tǒng)減弱p53的活性。基于這些結(jié)果，實(shí)驗(yàn)專注于Ccnd1、Cdk6和Ccng1，以使用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）驗(yàn)證這些基因的mRNA表達(dá)（圖1 c-e）。ICF 誘導(dǎo) iPSCs 中的Ccnd1、Ccng1 和Cdk6 mRNA 表達(dá)（圖1 c-e）。

 

圖1   ICF調(diào)節(jié)iPSCs中的P53和細(xì)胞周期通路
 

使用KEGG數(shù)據(jù)庫對用ICF和對照處理的iPSCs進(jìn)行RNA測序分析。熱圖顯示了P53信號通路和細(xì)胞周期通路（a、b）中差異表達(dá)的基因。 （c-e） 圖表示 RNA 測序結(jié)果中選定基因（Ccnd1、Ccng1 和Cdk6）的 mRNA 表達(dá)。
 

為了進(jìn)一步確認(rèn)生物學(xué)功能，在無血清培養(yǎng)基中ICF處理24 小時(shí)后，使用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞周期分析（條件1）。ICF處理導(dǎo)致SubG0群體減少，S期群體增加（圖2 b、c）。ICF后，將細(xì)胞在正常生長培養(yǎng)基（血清存在下）中維持48小時(shí)并用于細(xì)胞周期分析（圖2 a）（條件2）。與對照組相比，ICF刺激后G0/G1群體顯著減少，而S和G2/M群體顯著增加（圖2 e、f）。在兩種條件下，增殖指數(shù)均顯著增加（圖2 d、g）。

 

圖2   ICF促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程

實(shí)驗(yàn)方案如（a）所示。條件的細(xì)胞周期分析：（1）iPSCs在無血清培養(yǎng)基（b，c）中用ICF處理24小時(shí)，（2）24小時(shí)后，將細(xì)胞在正常生長培養(yǎng)基中維持48小時(shí)（e、f）。條件 1 和 2 中的增殖指數(shù)如（d、g） 所示。

 

ICF處理的SubG0細(xì)胞數(shù)量的減少意味著細(xì)胞凋亡的減少。為了確認(rèn)細(xì)胞凋亡的減少，用膜聯(lián)蛋白V和碘化丙啶（PI）對細(xì)胞進(jìn)行熒光染色，以鑒定早期和晚期細(xì)胞凋亡中的細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)顯示，ICF顯著減弱了早期凋亡細(xì)胞的數(shù)量，但不影響晚期凋亡細(xì)胞的數(shù)量（圖3 a、b）。

 

圖3   ICF減少早期凋亡細(xì)胞的數(shù)量
 

iPSCs在無血清培養(yǎng)基中用ICF處理24小時(shí)。細(xì)胞用膜聯(lián)蛋白V和碘化丙啶（PI）染色。早期和晚期凋亡細(xì)胞的百分比如（a、b）所示。

 

ICF通過TGF-β信號通路調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)

 

眾所周知，TGF-β信號通路在干細(xì)胞中受到機(jī)械應(yīng)力的刺激。由于Tgfb1被鑒定為通過ICF刺激差異表達(dá)的細(xì)胞周期基因（圖1 b），實(shí)驗(yàn)專注于TGF-β信號通路作為ICF調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)的可能機(jī)制。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析顯示，ICF刺激在24 h后顯著上調(diào)Tgfb1 mRNA表達(dá)（圖4 a）。酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）和免疫熒光染色也證實(shí)了24小時(shí)時(shí)顯著的Tgfb1蛋白表達(dá)（圖4 b、c）。

 

為了研究TGF-β信號通路在ICF調(diào)節(jié)細(xì)胞周期中的參與，用4 μmol·L−1SB431542，TGF-β受體的抑制劑，在ICF應(yīng)用前預(yù)處理iPSCs 30分鐘（實(shí)驗(yàn)方案如圖4 d所示）。SB431542減弱了ICF對Ccnd1和Cdk6 mRNA表達(dá)的影響（圖4 e、f）。相比之下，SB431542預(yù)處理后Ccng1 mRNA表達(dá)水平無顯著變化（圖4 g）。與mRNA結(jié)果相對應(yīng)，SB431542預(yù)處理降低了力誘導(dǎo)的Ccnd1蛋白表達(dá)（圖4 h）。

 

圖4   ICF通過TGF-β信號通路調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)
 

iPSCs在無血清培養(yǎng)基中用ICF處理。在2、8和24 h（a）使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR研究了Tgfb1 mRNA表達(dá)，并在24 h通過ELISA（b）和免疫熒光染色（c）測定Tgfb1蛋白表達(dá)。在TGF-β抑制實(shí)驗(yàn)中，在暴露于壓縮力之前用SB431542（4 μmol·L−1）處理細(xì)胞30分鐘。實(shí)驗(yàn)方案如（d）所示。Ccnd1、Ccng1 和Cdk6的 mRNA 如 e-g 所示。使用蛋白質(zhì)印跡分析（h）檢查Ccnd1的蛋白表達(dá)。

 

總之，該研究表明，ICF促進(jìn)iPSC增殖和細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞凋亡。TGF-β信號通路可能參與 iPSCs 中 ICF 誘導(dǎo)的細(xì)胞周期進(jìn)程。
 

參考文獻(xiàn)：Manokawinchoke J, Limraksasin P, Okawa H, Pavasant P, Egusa H, Osathanon T. Intermittent compressive force induces cell cycling and reduces apoptosis in embryoid bodies of mouse induced pluripotent stem cells. Int J Oral Sci. 2022 Jan 4;14(1):1. doi: 10.1038/s41368-021-00151-3. PMID: 34980892; PMCID: PMC8724316.

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34980892/

 

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