MPSⅡ敲除小鼠模型（IdS-KO）在黏多糖貯積癥MPS治療方法探究中的應(yīng)用

疾病診斷
黏多糖貯積癥對(duì)所有的器官和組織都會(huì)造成影響，并且隨著時(shí)間的推移逐漸惡化｡各型黏多糖貯積癥的臨床癥狀相互重疊，僅憑臨床特征難以作出準(zhǔn)確的診斷，需結(jié)合貯積產(chǎn)物、酶活力水平以及DNA水平的檢測(cè)，有助于疾病的診斷：

1、臨床表現(xiàn)
如果患者出生時(shí)正常，漸出現(xiàn)面容特殊，關(guān)節(jié)僵硬，爪形手時(shí)，X線檢查見(jiàn)肋骨飄帶，椎體前緣鳥(niǎo)喙?fàn)罡淖兊龋�提示黏多糖貯積癥Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅵ型或Ⅶ型的可能，進(jìn)一步行相關(guān)酶活性測(cè)定或基因突變分析可以鑒別｡

如果患者出生時(shí)正常，漸出現(xiàn)雞胸和脊柱后側(cè)凸，進(jìn)行性加重伴雙膝外翻，雙手腕關(guān)節(jié)下垂等，提示黏多糖貯積癥Ⅳ型的可能性，進(jìn)一步行酶活性測(cè)定或基因突變分析可以確診｡

如果患者出生正常，漸出現(xiàn)智力發(fā)育落后，多動(dòng)，有攻擊行為等，要考慮黏多糖貯積癥Ⅲ型的可能，進(jìn)一步行酶活性測(cè)定或基因突變分析可以確診｡
 

圖1 MPS患者大多會(huì)出現(xiàn)的癥狀
圖片來(lái)源：澎湃新聞 兒童醫(yī)學(xué)中心內(nèi)分泌科

2、尿黏多糖篩查
對(duì)尿樣中的氨基葡聚糖和寡糖進(jìn)行初篩查分析｡但是代謝物檢測(cè)存在出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果的風(fēng)險(xiǎn)｡

3、酶活性測(cè)定
通過(guò)對(duì)外周血細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞、骨髓抽提物等標(biāo)本中特異性溶酶體酶的活性檢測(cè)，對(duì)該組疾病進(jìn)行鑒別診斷和確診｡

4、基因診斷
該組疾病的基因突變譜非常明確，運(yùn)用基因檢測(cè)分析，可以在早期發(fā)現(xiàn)潛在的致病因素，在產(chǎn)前診斷中起重要作用｡

但基因分析方法本身也有一定的局限性，目前基因分析還不能對(duì)所有的黏多糖貯積癥做出明確診斷，而相應(yīng)的酶學(xué)檢測(cè)是從蛋白質(zhì)功能的角度直接檢測(cè)功能是否正常，因此對(duì)于黏多糖貯積癥的診斷來(lái)講酶學(xué)則更直接、快速、準(zhǔn)確^[1]｡

動(dòng)物模型
目前犬和鼠的IDUA基因已經(jīng)測(cè)序完成，它們的IDUA基因均與人的IDUA基因結(jié)構(gòu)相似｡犬與人的IDUA基因和蛋白均有82%同源性，鼠與人的cDNA和蛋白同源性為78%和77%｡正因?yàn)檫@種較高的同源性，我們可以制造MPS的動(dòng)物模型，用于進(jìn)一步探索該基因和新的治療方法^[2]｡

另有學(xué)者將新霉素抗性基因替換部分IDS基因（第4外顯子和第5號(hào)外顯子的部分序列)，建立MPSⅡ敲除小鼠模型（IdS-KO）。IDS基因的破壞導(dǎo)致IDS酶活性的喪失和組織GAG的積累。IdS-KO小鼠在出生后不久通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)試驗(yàn)進(jìn)行鑒定。從出生開(kāi)始觀察動(dòng)物的大體形態(tài)學(xué)變化。IdS-KO小鼠表現(xiàn)出了MPSⅡ的許多特征，包括骨骼異常、尿和組織GAG升高以及多種組織的空泡化^[3]。還有學(xué)者建立MPSⅡ小鼠模型（Ids^y/-）是通過(guò)靶向該基因的第4外顯子和部分第5外顯子而產(chǎn)生的^[4]。
 

圖2 Hunter綜合征的MPSII小鼠模型

圖注：雄性MPSⅡ(Ids^y/-)小鼠相對(duì)于野生型(wt)小鼠的大體形態(tài)表型。MPSⅡ小鼠表現(xiàn)為骨骼變形(A)，表現(xiàn)為顱面異常和脫發(fā)(B)，對(duì)野生型和Ids^y/-小鼠的蛋白提取物測(cè)定IDS活性(C)^[4]
 

圖3 GAG在雄性MPSⅡ(Ids^y/-)小鼠組織中的積累
 

圖注：野生型(wt、左)和MPSⅡ小鼠在第1天(p1、中)和第3天(p3、右)的肝、脾和肺的阿爾新藍(lán)組織切片染色顯示GAG的積累。箭頭表示GAG積累的藍(lán)色斑點(diǎn)。組織切片用核固紅試劑復(fù)染，放大倍數(shù)為20^[4]

治療方式
MPS治療一般包括對(duì)癥治療（非特異性療法）、酶替代療法（enzyme replacement therapy, ERT）、造血干細(xì)胞移植 (hematopoietic stem cell transplantation, HSCT)，還包括目前處于試驗(yàn)階段的基因治療等^[5]｡

1、對(duì)癥治療
主要針對(duì)呼吸及心血管系統(tǒng)合并癥、耳聾、腦積水、外科矯正和營(yíng)養(yǎng)支持等，改善生活質(zhì)量｡

2、酶替代療法（ERT）
酶替代療法是一種醫(yī)學(xué)常用的對(duì)癥治療方法，當(dāng)患者體內(nèi)缺失特定的酶時(shí)，通常采用此法進(jìn)行治療｡通過(guò)靜脈注射，向患者體內(nèi)注射含有缺失酶的藥劑，替代缺失的酶從而達(dá)到治療效果。隨著重組DNA技術(shù)的發(fā)展，使在體外生產(chǎn)溶酶體酶成為可能｡重組酶可以通過(guò)甘露糖-6-磷酸受體途徑轉(zhuǎn)運(yùn)到黏多糖貯積癥Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅵ型患者體內(nèi)，由體細(xì)胞進(jìn)行內(nèi)在化，并轉(zhuǎn)移到溶酶體內(nèi)，進(jìn)而降解積累的底物，減輕疾病的負(fù)擔(dān)｡酶替代療法已獲得監(jiān)管機(jī)構(gòu)的批準(zhǔn)，已在黏多糖貯積癥Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅵ型的治療中應(yīng)用｡目前，美國(guó)FDA已批準(zhǔn)6種治療用重組人蛋白藥物上市，治療MPSⅠ型Aldurazyme于2003年批準(zhǔn)，治療MPSⅡ型的Idursulfase于2006年批準(zhǔn)，MPSⅡ型的hunterase于2019年批準(zhǔn)，治療MPSⅣA型的vimizim于2019年批準(zhǔn)，治療MPSⅥ型的Naglazyme于2005年批準(zhǔn)，治療MPSⅦ型的mepseⅦ于2017年批準(zhǔn)^[1,6]｡有報(bào)道Denali Therapeutics公司的在研酶替代療法DNL310，是使用酶轉(zhuǎn)運(yùn)載體（ETV）技術(shù)開(kāi)發(fā)的能夠穿越血腦屏障的酶替代療法。公司公布的DNL310治療MPSⅡ患者的1/2期臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)，取得積極結(jié)果，該試驗(yàn)突破了原來(lái)酶替代療法不能穿過(guò)血腦屏障的限制^[8]。
 

圖4 Denali的轉(zhuǎn)運(yùn)載體平臺(tái)
圖片來(lái)源：Denali官網(wǎng)^[8]

3、造血干細(xì)胞移植（HSCT）
造血干細(xì)胞移植是指采集足夠數(shù)量的造血干細(xì)胞后，嚴(yán)密的進(jìn)行分型和配型，再移植到受體的治療過(guò)程。這種療法對(duì)MPSⅠ、MPSⅥ、Fabry病、Krabbe病等有一定的療效，但對(duì)MPSⅡ、MPSⅢ和MPSⅣ治療效果很差。這種治療可以在患者沒(méi)有出現(xiàn)任何臨床癥狀之前即可接受移植，這樣可以達(dá)到最大的治療效果，可維持正常發(fā)育和認(rèn)知功能，有望改善MPS患者關(guān)節(jié)活動(dòng)度降低、面部特征粗糙、上呼吸道阻塞、肝脾腫大等臨床表現(xiàn)。一旦出現(xiàn)了臨床癥狀或是體征，即使年齡很小時(shí)接受移植治療，也只能穩(wěn)定或是減慢疾病的進(jìn)程。因此，疾病的類型和接受移植治療時(shí)患者的疾病階段是決定療效和預(yù)后效果的重要因素^[1,5]。但也有文獻(xiàn)報(bào)道HSCT治療MPSⅡ有一定效果，可降低患兒的尿糖胺聚糖水平，多系統(tǒng)癥狀以及日常活動(dòng)能力均有改善^[7]。

4、基因治療
由于酶替代療法不適用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)治療，長(zhǎng)期使用還能造成免疫反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，由此基因治療法可為一種很有潛力的治療方法來(lái)彌補(bǔ)酶替代法的缺點(diǎn)。體外基因治療策略是通過(guò)分析MPS患者編碼缺陷酶的基因突變，將正常的酶基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞后再移植到患者體內(nèi)發(fā)揮酶的作用。體內(nèi)基因治療策略是直接注射基因轉(zhuǎn)移載體到組織，達(dá)到治療黏多糖貯積癥的目的，目前在動(dòng)物模型研究中已取得良好的效果。實(shí)驗(yàn)顯示非病毒型的載體RVs（Gamma-retroviruses）的基因治療方法可以糾正神經(jīng)系統(tǒng)的某些缺陷，但它不能通過(guò)血腦屏障。而另一種新型載體，AAV（adeno-associated virus）比前者更有應(yīng)用前景。如AAV9家族載體可以穿透血腦屏障，隨血液或腦脊液進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)改變內(nèi)皮細(xì)胞，神經(jīng)元細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞。該基因治療方法已在各種動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，犬類、豬乃至非人靈長(zhǎng)類實(shí)驗(yàn)中取得較好的治療效果。而且，AVV9載體有可能通過(guò)鼻內(nèi)途徑進(jìn)行中樞神經(jīng)系統(tǒng)障礙的改善^[1]｡

有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，使用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)將IDUA靶向人CD34⁺造血干細(xì)胞/祖細(xì)胞CCR5安全位點(diǎn)，改善了MPSⅠ小鼠異常的生化水平。體外使用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)對(duì)MPSⅠ最常見(jiàn)突變（如p.Trp402^∗）進(jìn)行糾正，結(jié)果顯示被轉(zhuǎn)染的MPSⅠ成纖維細(xì)胞IDUA活性顯著提高^[5]。

5、分子伴侶治療
能增強(qiáng)缺陷溶酶體酶的殘留活性。在生理?xiàng)l件下，天然小分子伴侶能夠啟動(dòng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)降解途徑清除錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)。研究表明，這些分子伴侶的作用方式為可逆地結(jié)合錯(cuò)義突變的酶的活性位點(diǎn)，校正蛋白的錯(cuò)誤折疊并遞送到溶酶體，在溶酶體的酸性環(huán)境中，分子伴侶被釋放，突變的酶執(zhí)行其功能｡這種方法已被用來(lái)治療Fabry病、Ⅰ型Gaucher病、Pompe病、GM1神經(jīng)節(jié)苷脂貯積病、Tay-Sachs病和Sandoff病。此外，分子伴侶能夠穿過(guò)血腦屏障，有治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的潛在可能^[1]｡

參考文獻(xiàn)及引用圖片來(lái)源：
[1]曹健,齊曉麗,劉衛(wèi)德,劉曉敏,胡潔,胡滋,余涵燕,郝淑靜.亞洲地區(qū)黏多糖貯積癥的研究進(jìn)展[J].齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2015,36(25):3847-3850.

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[4]Cardone M, Polito VA, Pepe S, Mann L, D’Azzo A, Auricchio A, et al. Correction of Hunter syndrome in the MPSII mouse model by AAV2/8-mediated gene delivery. Human molecular genetics. 2006; 15 (7):1225–36. Epub 2006/03/01. doi: 10.1093/hmg/ddl038 PMID: 16505002.

[5]戴陽(yáng)麗,朱銘強(qiáng),鄒朝春.黏多糖貯積癥Ⅰ型的研究現(xiàn)狀及進(jìn)展[J].中華內(nèi)分泌代謝雜志,2021,37(04):306-310.

[6]何心,許靜,徐進(jìn).治療兒童黏多糖貯積癥IVA型新藥elosulfasealfa[J].中國(guó)新藥雜志,2015,24(08):841-843+856.

[7]中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)內(nèi)分泌遺傳代謝學(xué)組.黏多糖貯積癥Ⅱ型臨床診斷與治療專家共識(shí)[J].中華兒科雜志,2021,59(06):446-451.

[8]https://new.qq.com/rain/a/20210304A01FAO00