植物成像應用：過氧化氫感受器過程中所使用的鈣成像方法研究
（注：因HPCA1屬于LRR-RK受體激酶亞家族，在上篇文章中，我們并未對其在“受體”或“感受器”上的稱呼做嚴格限定，鑒于相關植物學研究領域老師的指正，我們遵照裴老師文章中出現頻率較多的sensor這一描述，將HPCA1稱為過氧化氫的“感受器”或“傳感器”，特此說明。）
在本篇文章中，我們從原文的龐大實驗體系中重點選取與細胞內Ca2+成像相關的實驗與發(fā)現為大家做詳細介紹，以期可以為進行類似研究的老師們提供思路和方法學上的參考。
eH2O2誘導的[Ca2 +] i增加缺陷型突變體（hpca1）的篩選實驗過程中，研究人員使用基于Ca2+成像的正向遺傳篩選法，對植物體內的胞漿鈣濃度（[Ca2 +] i）進行測量，進而分離得到eH2O2誘導的[Ca2 +] i增加缺陷型突變體（hpca1），用于后續(xù)研究。具體的實驗過程如下：
使用組成型表達細胞內Ca2 +指示劑水母發(fā)光蛋白（pMAEQUORIN2）的Col-0品系擬南芥植株，于成像前12h均勻地施加3 ml 10 µM腔腸素（水母發(fā)光蛋白的作用底物）。篩選出可穩(wěn)定表達水母發(fā)光蛋白的M2種子后，對培養(yǎng)的幼苗使用4 mM H2O2處理3min，在此期間連續(xù)進行水母發(fā)光蛋白的信號采集（Ca2+成像），進而篩選出對H2O2所誘導的[Ca2 +] i增加不敏感的擬南芥幼苗，作為hpca突變體候選株進行單獨收集。
對照實驗：將圖1a中使用的野生型和hpca1擬南芥幼苗，用含有0.9 M CaCl2和10％（v / v）乙醇的溶液處理（刺激水母發(fā)光蛋白發(fā)光），對剩余的發(fā)光總量進行成像以及定量。結果顯示，野生型和hpca1幼苗中的水母發(fā)光蛋白總量相似，說明圖1a中，hpca1幼苗的生物發(fā)光減弱與其水母發(fā)光蛋白的含量無關，確實是由于對H2O2的響應存在缺陷而導致。
與其他兩類突變體相比，hpca1突變體對H2O2具有特異性
為了確定hpca1突變體與已知的滲透壓osca1和鹽敏感型moca1突變體相比，對H2O2具有特異性，研究人員將它們并排生長并檢查其各自的Ca2 +表型。
驗證hpca1基因的突變是導致eH2O2感知缺陷的原因
利用全基因組重測序的方法對HPCA1進行鑒定，發(fā)現其為一種富含亮氨酸的重復受體激酶（LRR-RK）。為了證明hpca1基因的突變是導致eH2O2感知缺陷的原因，研究人員將HPCA1和hpca1突變體進行互補性重組，并對重組后的幼苗用4mMH2O2處理后進行Ca2+成像，結果表明HPCA1可以“拯救”hpca1突變體表型，說明hpca1正是導致缺陷型的基因。
HPCA1是否適用于其他LRR-RK傳導機制的探究
另一方面，研究人員想要探究HPCA1對于H2O2是否具有特異性，或HPCA1是否更普遍地適用于其他LRR-RK傳導機制——感知生物刺激并觸發(fā)NADPH氧化酶介導的H2O2生成。
鞭毛蛋白肽flg22和延伸因子Tu（EF-Tu）衍生的肽elf18和elf26都是與微生物相關的分子模式（MAMPs）。在先天性免疫中，MAMPs的受體通常是受體激酶，如LRR-RKs、FLS2和EFR分別是flg22和elf18-elf26的受體。flg22和elf18-elf26均可引起[Ca2 +] i增加，這在其相應的受體突變體fls2和efr中則被消除。
研究人員分析了HPCA1是否可以區(qū)分MAMPs處理后產生的H2O2，發(fā)現在hpca1突變體中，由flg22觸發(fā)的[Ca2 +] i增加不受影響。FLS2及其共受體BAK1的突變體對flg22觸發(fā)的[Ca2 +] i增加表現出缺陷，但對于eH2O2誘導的[Ca2 +] i增加則表現出野生型水平。
考慮到保衛(wèi)細胞中抗過氧化氫1（ghr1）突變體在eH2O2和ABA信號傳導中均表現出強表型，研究人員對hpca1和ghr1突變體也進行了比較，發(fā)現eH2O2誘導的[Ca2 +] i增加在ghr1突變體中不受影響。
這些結果表明，保衛(wèi)細胞中的eH2O2信號傳導涉及多個LRR-RK，HPCA1可能是GHR1上游的eH2O2傳感器。
HPCA1的胞質結構域具有激酶活性
為確定HPCA1的胞質結構域（HPCA1CD）是否具有激酶活性或僅充當支架結構，研究人員準備了野生型HPCACD以及三種無活性的激酶突變體：HPCA1（K659E）CD——與ATP結合相關，HPCA1（D773L）CD——與催化相關，HPCA1（Q856 *）CD——結構域被截短。
利用這三種激酶突變體構建的HPCA1與hpca1-2突變植株進行互補性重組，發(fā)現這些激酶突變體不能恢復hpca1-2的表型，說明HPCA1的胞質結構域（HPCA1CD）發(fā)揮激酶活性的作用。
HPCA1在其胞外區(qū)域具有2個特殊的Cys殘基對，為了探究這2個殘基對的作用，研究人員使用Cys突變的HPCA1對hpca1突變體進行互補重組，對重組后的樣本使用4mM H2O2處理。
Ca2+成像結果顯示，Cys突變的HPCA1無法恢復hpca1-2突變體的表型，說明胞外Cys殘基對對于感應eH2O2是必不可少的。
圖5 | Cys突變的HPCA1 × hpca1-2突變體中，Ca2+成像發(fā)光信號大幅度減弱，即Cys突變的HPCA1無法恢復hpca1-2突變體的表型。
擴展數據圖6：
對照實驗：將圖5e中使用的各組擬南芥幼苗，用含有0.9 M CaCl2和10％（v / v）乙醇的溶液處理（刺激水母發(fā)光蛋白發(fā)光），對剩余的發(fā)光總量進行成像。對于所有基因型，檢測到相似的發(fā)光強度。說明圖5e中Cys突變的HPCA1 × hpca1-2突變體的發(fā)光信號大幅度減弱與其水母發(fā)光蛋白的含量無關，而是由于其對H2O2的響應存在缺陷而導致。
基于水母發(fā)光蛋白生物發(fā)光的Ca2+成像過程由配備了不透光暗箱的超低溫背照式CCD相機（ChemiPro HT系統(tǒng)）以及配備了H-800不透光可控環(huán)境箱的新型Lumazone系統(tǒng)（(Pylon1300B）完成。將液氮自動填充系統(tǒng)連接到成像系統(tǒng)以提供恒定的冷卻溫度。CCD相機由WinView軟件控制，并使用MetaMorph 6.3等軟件進行生物發(fā)光圖像的分析。
注：ChemiPro HT系統(tǒng)、Lumazone Pylon1300B系統(tǒng)、液氮自動填充系統(tǒng)以及WinView控制軟件均由Roper Scientific以及Bio-One Scientific Instrument（博益科學儀器）提供。
H-800不透光可控環(huán)境箱由Bio-One Scientific Instrument（博益科學儀器）獨家研發(fā)，適用于植物活體成像過程中對于實驗植株的培養(yǎng)與拍攝，可控制溫度和光照強度，提供穩(wěn)定均一的生長和實驗條件。
MetaMorph 6.3（Molecular Devices, USA）等圖像分析軟件由Bio-One Scientific Instrument（博益科學儀器）提供。
設備使用期間，由北京博益?zhèn)I(yè)儀器有限公司負責提供鈣離子成像、圖像分析軟件、環(huán)境控制培養(yǎng)箱、CCD液氮制冷裝置等相關部分的技術支持和售后服務工作。
除了采用基于水母發(fā)光蛋白生物發(fā)光的Ca2 +成像技術進行相關研究外，研究人員在實驗過程中還采用了基于黃色Cameleon 3.6（YC3.6）的Ca2+成像方法，用以評估hpca1突變體中保衛(wèi)細胞eH2O2 Ca2+信號傳導受損的情況。實驗方法描述如下：
將hpca1突變體雜交到組成型表達Ca2 +傳感器YC3.6的野生型植株中并進行Ca2 +成像，對產生的五個以上的純和品系進行分析。之后，將來自三周齡植株的蓮座葉表皮置于含有100μM CaCl2、5 mM KCl和10 mM MES-Tris（pH 6.15）的微孔室中，在光照下放置2.5 h。
使用配備有兩個濾光輪（Lambda 10-3 / 10-2）和低溫CMOS或CCD相機（Prime sCMOS / CoolSNAPfx）的熒光顯微鏡進行比率式Ca2 +成像。在440 nm處進行激發(fā)，并使用MetaFluor軟件（Molecular Devices）收集發(fā)射比率為F535 nm / F485 nm的圖像。
考慮到eH2O2觸發(fā)了保衛(wèi)細胞中[Ca2 +] i的增加和氣孔的關閉，實際檢測時，確實可以在hpca1突變體中觀察到保衛(wèi)細胞內的eH2O2 Ca2 +信號降低，并且響應eH2O2的氣孔關閉數量減少。
這些結果表明，在hpca1突變體的保衛(wèi)細胞中，eH2O2所誘導的Ca2 +信號通路存在明顯缺陷。
對照實驗：將圖5e中使用的各組擬南芥幼苗，用含有0.9 M CaCl2和10％（v / v）乙醇的溶液處理（刺激水母發(fā)光蛋白發(fā)光），對剩余的發(fā)光總量進行成像。對于所有基因型，檢測到相似的發(fā)光強度。說明圖5e中Cys突變的HPCA1 × hpca1-2突變體的發(fā)光信號大幅度減弱與其水母發(fā)光蛋白的含量無關，而是由于其對H2O2的響應存在缺陷而導致。
基于水母發(fā)光蛋白生物發(fā)光的Ca2+成像過程由配備了不透光暗箱的超低溫背照式CCD相機（ChemiPro HT系統(tǒng)）以及配備了H-800不透光可控環(huán)境箱的新型Lumazone系統(tǒng)（(Pylon1300B）完成。將液氮自動填充系統(tǒng)連接到成像系統(tǒng)以提供恒定的冷卻溫度。CCD相機由WinView軟件控制，并使用MetaMorph 6.3等軟件進行生物發(fā)光圖像的分析。
注：ChemiPro HT系統(tǒng)、Lumazone Pylon1300B系統(tǒng)、液氮自動填充系統(tǒng)以及WinView控制軟件均由Roper Scientific以及Bio-One Scientific Instrument（博益科學儀器）提供。
H-800不透光可控環(huán)境箱由Bio-One Scientific Instrument（博益科學儀器）獨家研發(fā)，適用于植物活體成像過程中對于實驗植株的培養(yǎng)與拍攝，可控制溫度和光照強度，提供穩(wěn)定均一的生長和實驗條件。
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除了采用基于水母發(fā)光蛋白生物發(fā)光的Ca2 +成像技術進行相關研究外，研究人員在實驗過程中還采用了基于黃色Cameleon 3.6（YC3.6）的Ca2+成像方法，用以評估hpca1突變體中保衛(wèi)細胞eH2O2 Ca2+信號傳導受損的情況。實驗方法描述如下：
將hpca1突變體雜交到組成型表達Ca2 +傳感器YC3.6的野生型植株中并進行Ca2 +成像，對產生的五個以上的純和品系進行分析。之后，將來自三周齡植株的蓮座葉表皮置于含有100μM CaCl2、5 mM KCl和10 mM MES-Tris（pH 6.15）的微孔室中，在光照下放置2.5 h。
使用配備有兩個濾光輪（Lambda 10-3 / 10-2）和低溫CMOS或CCD相機（Prime sCMOS / CoolSNAPfx）的熒光顯微鏡進行比率式Ca2 +成像。在440 nm處進行激發(fā)，并使用MetaFluor軟件（Molecular Devices）收集發(fā)射比率為F535 nm / F485 nm的圖像。
考慮到eH2O2觸發(fā)了保衛(wèi)細胞中[Ca2 +] i的增加和氣孔的關閉，實際檢測時，確實可以在hpca1突變體中觀察到保衛(wèi)細胞內的eH2O2 Ca2 +信號降低，并且響應eH2O2的氣孔關閉數量減少。
這些結果表明，在hpca1突變體的保衛(wèi)細胞中，eH2O2所誘導的Ca2 +信號通路存在明顯缺陷。
圖6 | a：在加入2 mM H2O2之前的20秒和之后的140秒，每4秒鐘拍攝一次表達YC3.6的植株中表皮條的比例圖像。b：根據a中實驗的時間進程，對[Ca2 +] i進行量化分析。
注：低溫Prime sCMOS相機、CoolSNAPfx CCD相機（Photometrics, USA）和MetaFluor軟件（Molecular Devices, USA）均由Bio-OneScientific Instrument（博益科學儀器）提供。
設備使用期間，由北京博益?zhèn)I(yè)儀器有限公司負責提供相應的技術支持和售后服務工作。
總結：
作為生物體內一種重要的信號傳導介質，Ca2+具有獨特的生物學功能，參與多種細胞對于外部刺激的感應以及內部分子事件的調控過程。裴真明教授課題組的研究人員，采用基于生物發(fā)光蛋白（水母發(fā)光蛋白）以及熒光蛋白鈣指示劑（YC3.6）的Ca2+成像方法，完成了在發(fā)現植物細胞表面過氧化氫感受器HPCA1過程中所涉及的多項探究任務，如利用正向遺傳篩選法分離得到突變體植物、驗證目標植株、目標基因和目標蛋白的特異性等。成像方法的應用，使得結論的得出及證明過程更加簡便、高效和直觀。因此，我們特意梳理出上述涉及Ca2+成像的實驗方法與大家做交流，希望從事相關植物學研究的老師們可以對這些技術方法有更進一步的了解，對于今后開展相關研究有所助益。
注：低溫Prime sCMOS相機、CoolSNAPfx CCD相機（Photometrics, USA）和MetaFluor軟件（Molecular Devices, USA）均由Bio-OneScientific Instrument（博益科學儀器）提供。
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總結：
作為生物體內一種重要的信號傳導介質，Ca2+具有獨特的生物學功能，參與多種細胞對于外部刺激的感應以及內部分子事件的調控過程。裴真明教授課題組的研究人員，采用基于生物發(fā)光蛋白（水母發(fā)光蛋白）以及熒光蛋白鈣指示劑（YC3.6）的Ca2+成像方法，完成了在發(fā)現植物細胞表面過氧化氫感受器HPCA1過程中所涉及的多項探究任務，如利用正向遺傳篩選法分離得到突變體植物、驗證目標植株、目標基因和目標蛋白的特異性等。成像方法的應用，使得結論的得出及證明過程更加簡便、高效和直觀。因此，我們特意梳理出上述涉及Ca2+成像的實驗方法與大家做交流，希望從事相關植物學研究的老師們可以對這些技術方法有更進一步的了解，對于今后開展相關研究有所助益。
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北京博益Bio-one成立于2004年，一直專注于生物樣本庫建設、植物活體分子標記成像系統(tǒng)、三維活體小動物熒光斷層成像技術、大分子與細胞膜表面受體相互作用等領域，致力于為科研用戶提供更新的技術與服務。自2006年，我們開始參與農業(yè)種子基因庫與臨床樣本庫的設計與施工，積累了13年的4°C、-20°C、-80°C、液氮溫區(qū)庫等管理與維護經驗；同時，自2008年開始，成像事業(yè)部追蹤最新的活體成像技術，不斷完善細胞-組織-活體的成像解決方案。欲了解上述領域內更多最新的技術文獻與資訊，歡迎您關注此公眾號或訪問本司官網 http://www.bio-one.cn。
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