3D類器官的發(fā)展、分類、培養(yǎng)實驗流程及未來發(fā)展

01 你聽說過類器官嗎？
我們在國外生化類科幻大片中經(jīng)�？吹饺嗽烊�，在制作改造人之前他們會做一些人造器官，所有我們經(jīng)常會看到一些心臟或者其他器官在培養(yǎng)液中的畫面，當然這些都是人們的腦洞所想象出的科幻電影。但是我們目前的科研水平已經(jīng)實現(xiàn)了3D類器官的構建。2009年，荷蘭Hubrecht研究所的 Hans Clevers 團隊成功的將成體干細胞培養(yǎng)成為小腸的隱窩和絨毛結構，開啟了類器官發(fā)展的新篇章。下面小愛繼續(xù)給您介紹什么是類器官？

 

Hans Clevers-小腸干細胞marker Lgr5發(fā)現(xiàn)者

02 什么是類器官？
類器官顧名思義就是一種類似器官但又不是器官的3D細胞團結構。通過在體外培養(yǎng)胚胎或成體干細胞，讓其增殖分化形成具有一定形態(tài)結構及功能的類似于器官的3D細胞團結構。這些細胞結構雖然不是真正意義上的人類器官，但能在某些結構和功能上模擬真實器官，因此，把這些微型人造器官命名為：類器官（organoids）。

類器官明場圖及組化鑒定

03 類器官的發(fā)展史
類器官的研究熱點主要是病人來源的類器官 (Patient-Derived Organoids, PDOs)，因為通常用于腫瘤患者的疾病建模、研究與藥物篩選，常常被稱為腫瘤類器官。腫瘤類器官的發(fā)展開始于2013年，自此之后呈逐年上升趨勢。腫瘤類器官是指將患者活檢、穿刺或手術切除組織在基質(zhì)膠中培養(yǎng)數(shù)周得到的類器官。腫瘤類器官在高度保持源腫瘤的異質(zhì)性和患者之間的異質(zhì)性的同時，類器官個體間形態(tài)、尺度保持基本均一，為腫瘤發(fā)病機理研究、藥物篩選、個性化精準醫(yī)療、再生醫(yī)學等領域提供了快速、優(yōu)良的技術平臺。

類器官的發(fā)展成果，主要集中在近十余年。
•  2007年，Hans Clevers 的實驗室通過 lineage tracing 驗發(fā)現(xiàn)小腸和結腸的干細胞為 Lgr5+細胞。
•  2009年，Hans Clevers實驗室使用單個鼠LGR5+腸干細胞在體外自組織成為具有腸隱窩-絨毛結構的腸類器官。
•  2011年，由人多能干細胞和原代成體干細胞發(fā)育而來的腸類器官被成功制作。同年，由鼠胚胎干細胞培育而來的視網(wǎng)膜類器官被首次成功培育。
•  2012年，由人多能干細胞發(fā)育而來的視網(wǎng)膜類器官成功培育。
•  2013年，由人多能干細胞發(fā)育而來的腦類器官被成功培育。肝、腎、胰類器官被成功培育。
•  2014年，前列腺、肺類器官被成功培育。
•  2015年，乳腺、輸卵管、海馬體類器官被成功培育。
•  2020年，蛇毒液腺類器官被成功培育。

04 類器官的分類
目前類器官分為兩類：組織來源類器官和多能干細胞來源類器官。下面是已經(jīng)構建成功的類器官種類

05為什么要“類器官”
相比傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)模型，類器官代表著一種能夠概括整個生物體生理過程的創(chuàng)新技術，具有更接近生理細胞組成和行為、更穩(wěn)定的基因組、更適合于生物轉(zhuǎn)染和高通量篩選等優(yōu)勢。而與動物模型相比，類器官模型的操作更簡單，還能用于研究疾病發(fā)生和發(fā)展等機理。因而在器官發(fā)育、精準醫(yī)療、再生醫(yī)學、藥物篩選、基因編輯、疾病建模等領域都有廣泛的應用前景。

類器官 VS 組織樣本 VS 動物模型

06 類器官相關研究實驗流程
類器官的培養(yǎng)可以利用體細胞、成體干細胞（包括祖細胞）或多能干細胞。類器官培養(yǎng)系統(tǒng)主要包括基質(zhì)膠、維持類器官生態(tài)所需因子和分化所需因子這幾個主要元素�；�質(zhì)膠中含有膠原、巢蛋白和纖連蛋白等等，為類器官形成三維空間結構提供基質(zhì)。維持類器官生態(tài)因子主要目的為促進細胞的增殖和抑制細胞凋亡等。

下面以小腸組織為例
實驗材料
1、 儀器設備
CO2 培養(yǎng)箱、雙人單面超凈臺、倒置顯微鏡、臺式冷凍離心機、水浴鍋、水浴搖床，醫(yī)用冰箱、-80°冰箱、移液器（一套）、眼科剪、眼科鑷。

2、 試劑耗材
腸癌類器官培養(yǎng)試劑盒(abs9445)，基質(zhì)膠(abs9495)，60mm細胞培養(yǎng)皿，100μm濾篩，15ml離心管，1.5ml EP管若干，4度冰盒，眼科剪刀，眼科鑷，

試劑盒組成

組分	名稱	規(guī)格	保存
A組分	結直腸癌類器官緩沖液	100ml	4℃
B組分	結直腸癌類器官基礎培養(yǎng)基	100ml	4℃
C組分	organo原代酶解液	25ml	4℃
D組分	organo消化液	25ml	4℃
E組分	organo原代酶終止液	100ml	4℃
F組分	組織保存液	100ml	4℃
G組分	organo凍存液	25ml	4℃

實驗方法
1、原代
（1）將組織放入含有特殊組織保存液F的組織取樣瓶中放入冰盒4℃，拍照并登記信息。
（2）取樣瓶消毒，組織放入培養(yǎng)皿，結直腸癌類器官緩沖液A清洗三次后于培養(yǎng)皿中剪碎，大約1mm3的組織塊。
（3）癌組織用organo原代酶解液C消化，37℃震蕩消化10-20 min，（消化過程中隨時觀察消化情況）加入三倍體積organo原代酶終止液E終止消化。
（4）使用100μm孔徑的篩網(wǎng)進行過濾，取少量濾液在鏡下進行觀察，可以看到明顯的組織塊，將濾液收集后于300g富集離心3-5min后移去上清，重新重懸離心。
（5）去除上清，使用適量基質(zhì)膠（abs9495）進行重懸(24孔板為例，每孔30ul）之后進行鋪板（4℃下操作）拍照追蹤定位。
（6）將鋪好的板子放入37℃培養(yǎng)箱中10-15min成膠，添加培養(yǎng)基B（恢復室溫）進行培養(yǎng)。

2、類器官傳代培養(yǎng)
（1）移液器吸去培養(yǎng)基，添加4℃類器官緩沖液A放置一分鐘。
（2）移液槍輕柔吹打基質(zhì)膠，收集在15ml離心管中，4℃靜置5min。（3）離心5min棄去液體，添加適量類器官緩沖液A重懸移入1.5ml離心管，300g離心5min棄去液體或（添加適量消化液D作用90-120S終止，離心5min棄去混合液）。
（4）類器官收集后，添加適量類器官凍存液G，按500個/ml密度凍存（或進行步驟5）。
（5）類器官收集后，基質(zhì)膠重懸，每孔30μl基質(zhì)膠鋪在24孔板中，放置培養(yǎng)箱中10min添加500μl結直腸癌類器官培養(yǎng)基B。

3、凍存
（1）在傳代第二步，添加凍存液
（2）500個/ml 密度凍存，溫度梯度降溫-80度，保存

4、類器官復蘇
（1）取10ml于15ml離心管中。
（2）從液氮罐中取出凍存的腫瘤類器官細胞，快速置于 37℃水浴鍋中融解。
（3）水浴融解過程中，需輕輕搖動冷凍管，以確保凍存液在 1-2 分鐘內(nèi)完全融解。
（4）將溶解后的類器官細胞快速轉(zhuǎn)移至15ml 無菌離心管，使用移液管輕輕吹打3次，300g 離心 3分鐘，然后除去上清液并收集類器官細胞沉淀。添加適量結直腸癌類器官緩沖液A重懸移入1.5ml離心管300g離心5min。
（5）基質(zhì)膠重懸，每孔20μl基質(zhì)膠鋪在24控板中，放置培養(yǎng)箱中10min添加500μl結直腸癌類器官培養(yǎng)基B。

5、鑒定
類器官的鑒定主要有形態(tài)學觀察、基因分析、標志物檢測、組織學染色這幾種手段。

6、藥敏
（1）藥物準備階段（藥物種類、濃度）。
（2）在傳代基礎上接種到96孔板上，加藥，牌照。在藥物活性第5天檢測細胞活性。

類器官藥敏檢測全流程

 

類器官	細胞因子	小分子化合物
小腸/結腸類器官	EGF、Noggin、R-Spondin 1、Wnt-3a	A 83-01、Gastrin、Nicotinamide、SB 202190、Y 27632
胃類器官	FGF-10、 EGF、Noggin、R-Spondin 1、Wnt-3a	A 83-01、Gastrin、Nicotinamide、SB 202190、Y 27632
肝臟類器官	BMP-4、EGF、FGF-basic、FGF-10、HGF、Noggin、Wnt-3a	A 83-01、DAPT、Forskolin、Gastrin、Nicotinamide、Y 27632、Prostaglandin E2
肺類器官	Activin A、FGF-basic、FGF-4、Noggin	CHIR 99021、SB 431542
前列腺類器官	EGF、Activin A、FGF-basic、FGF-10、Noggin、R-Spondin 1、Wnt-10b	A 83-01、SB 202190、Y 27632、Prostaglandin E2、Nicotinamide、Testosterone
胰腺類器官	FGF-10、 EGF、Noggin、R-Spondin 1、Wnt-3a	A 83-01、Nicotinamide、Gastrin
腎類器官	BMP-2、BMP-4、BMP-7、FGF-basic、FGF-9	CHIR 99021、Retinoic Acid
乳腺類器官	Heregulinβ-1、R-Spondin 1、R-Spondin 2、Noggin、EGF、 FGF-basic、FGF-10、Wnt-3a	Prolactin、Y 27632
腦類器官	FGF-basic、Noggin、DKK-1、 EGF、BDNF、GDNF	MK-2206、GDC-0068、Dorsomorphin、Y 27632
視網(wǎng)膜類器官	SHH、Wnt-3a	CHIR 99021、Y 27632
內(nèi)耳類器官	BMP-4、 FGF-basic	A 83-01、SB 431542

07 類器官研究相關技術及解決方案
1 基因編輯技術在類器官研究中的應用
CRISPR-Cas9是細菌和古細菌在長期演化過程中形成的一種適應性免疫防御，可用來對抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR-Cas9基因編輯技術，則是對靶向基因進行特定DNA修飾的技術，這項技術也是用于基因編輯中前沿的方法。

2020年3月2日，荷蘭胡布勒支研究組在Nature Cell Biology雜志上發(fā)表文章Fast and efficient generation of knock-in human organoids using homology-independent CRISPR–Cas9 precision genome editing，利用非同源依賴的CRISR-Cas9技術快速高效地對人源類器官進行基因敲入，作者們將該技術命名為CRISPR–HOT(CRISPR-Cas9-mediated homology-independent organoid transgenesis)，為人源類器官的內(nèi)源基因敲入提供了重要的工具平臺。

文章通過使用CRISPR-HOT的遺傳工具來研究肝細胞如何分裂和具有太多DNA的異常肝細胞如何出現(xiàn)。通過讓癌基因TP53失去功能，他們發(fā)現(xiàn)異常肝細胞的非結構化分裂更為頻繁，這可能有助于促進癌癥產(chǎn)生。隨后使用CRISPR-HOT將熒光標記插入人類類器官的DNA中，從而使得這些熒光標記附著在他們想要研究的特定基因上，建立了人肝臟導管類器官的報告基因品系，可以利用活體成像、切片染色等方式可視化觀察內(nèi)源表達的基因表達模式以及動態(tài)變化過程。

2 類器官在研究疾病發(fā)生發(fā)展的機制中應用-基因編輯
研究背景：在印戒癌(SRCC)中常見E-鈣粘蛋白的表達缺失，CDH1基因編碼E-鈣粘蛋白，是鈣依賴性細胞粘附蛋白，屬于鈣粘蛋白家族成員，CDH1基因參與調(diào)節(jié)細胞粘附、遷移和上皮細胞增殖，其功能缺失導致細胞更容易侵襲與轉(zhuǎn)移，該基因的突變與胃癌密切相關。因此，E-鈣粘蛋白表達的缺失可能會增加患胃癌的概率。

2022年6月，日本科研團隊在Gastric Cancer上發(fā)表了Potential therapeutic targets discovery by transcriptome analysis of an in vitro human gastric signet ring carcinoma model，利用基本編輯技術，敲出了正常胃癌類器官的CDH1基本，，構建了E-鈣粘蛋白的胃癌類器官模型。

通過RNA-seq測序，研究發(fā)現(xiàn)敲除后的腫瘤類器官與SRCC的細胞形態(tài)和細胞活力類似，同時還發(fā)現(xiàn)，CDH 1 KO hGO細胞中matrix metalloproteinase (MMP）基因上調(diào)，MMP為水解細胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)的酶類，包括基質(zhì)中以及整合于質(zhì)膜中的各種膠原酶和彈性蛋白酶等。然后科學家們對95例臨床胃癌組織樣本進行免疫熒光驗證，結果顯示，MMP-3 的確在臨床樣本中高表達。此外發(fā)現(xiàn)，CXCR4從細胞核易位細胞膜上，加入CXCR4的配體CXCL12后，基因敲除的類器官生長期變長，在臨床SRCC患者中纖維細胞分泌高表達CXCL12。從而得出結論MMP和CXCL12/CXCR4有望成為E -cadherin缺陷性SRCC的新治療靶點。

3 單細胞測序中類器官技術應用
單細胞測序技術也是近年來受到青睞的明星技術，分別在2018年和2019年被 Science 期刊評為年度十大技術，被 Nature methods 評為年度方法。高通量單細胞測序技術通過對每個細胞遺傳物質(zhì)的分析，在單細胞分辨率下研究細胞的發(fā)育、分化，成為探索組織發(fā)育、腫瘤異質(zhì)性等生物問題的重要方法。單細胞轉(zhuǎn)錄組測序與類器官結合，pubmed關鍵詞搜索已經(jīng)達到251篇，類器官技術極大推動了器官發(fā)育、腫瘤研究、藥物篩選、臨床研究等多個領域的發(fā)展。

2021年11月，德國科學家團隊在 nature communication上發(fā)表了Single-cell analysis of patient-derived PDAC organoids reveals cell state heterogeneityand a conserved，文章構建了18個原發(fā)性胰腺導管腺癌和6個胰腺導管腺癌肝轉(zhuǎn)移腫瘤類器官，通過10X genomic單細胞轉(zhuǎn)錄組測序比較分析腫瘤類器官和原發(fā)性 PDAC，鑒定共有細胞亞群，包括循環(huán)祖細胞和分化的分泌細胞亞群。“classical”細胞亞群為胰腺導管腺癌分化發(fā)育的最終形態(tài)。在基于活體成像的藥物篩選實驗中，發(fā)現(xiàn)“classical”亞群細胞基因表達，則對藥物反應敏感。

PDAC離體腫瘤樣本很難獲取，且惡性細胞含量較低。通過建立 PDAC單細胞轉(zhuǎn)錄圖譜，顯示與原組織相似，證明了 PDAC 類器官可作為腫瘤異質(zhì)性體外研究的臨床相關模型，可為患者臨床治療預后判斷提供依據(jù)。

08類器官的未來發(fā)展
1 類器官未來發(fā)展方向-血管生成
目前大多類器官本身并不具備血管化的結構。隨著類器官體積的增長，類器官受限于氧氣的缺失以及代謝廢物的增加，可能導致的組織壞死。已有研究構建血管內(nèi)皮細胞微環(huán)境的腫瘤類器官，將類器官腫瘤細胞和血管內(nèi)皮細胞在Matrigel上共同培養(yǎng)，生成血管結構以期解決類器官血管化缺失的問題

2 類器官未來發(fā)展方向-共培養(yǎng)
2019年Nature Protocol 期刊發(fā)表了腫瘤類器官和免疫細胞共同培養(yǎng)的相關protocol，可以體現(xiàn)和模擬出腫瘤微環(huán)境的部分特征。以上皮類器官和免疫細胞共培養(yǎng)模型為例，可通過在培養(yǎng)基中添加活化的免疫細胞、在組織消化成單細胞后和免疫細胞共同生長、添加ECM中的重組細胞因子等方法重塑類器官和免疫細胞的相互作用。

3 類器官未來發(fā)展方向-標準化
標準的形成，是在中國干細胞標準委員會及陳曄光院士的支持和推動下，由陳曄光院士團隊聯(lián)合國內(nèi)幾十家單位制定。編者聯(lián)合學術界、產(chǎn)業(yè)界專家對腸癌類器官的培養(yǎng)，鑒定和質(zhì)控等一系列過程進行了探討，經(jīng)過大量數(shù)據(jù)研究及充分研討，最終形成國內(nèi)首個人腸癌類器官標準，為類器官技術的臨床研究和臨床實踐提供了規(guī)范和指導。

該標準規(guī)定了人腸癌類器官及人腸道類器官的定義、倫理要求、技術要求和檢測方法，為患者來源的人腸癌類器官的制備和檢測提供了技術支持。該標準的制定獲得了類器官及標準領域中外專家廣泛的關注與高度評價。