免疫熒光顯微成像詳解（上）免疫熒光原理與步驟

前言

免疫熒光技術(shù)是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項技術(shù)，它是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標記在抗體（或抗原）上，與其相應的抗原（或抗體）結(jié)合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應。利用熒光顯微鏡可以看見熒光所在的細胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)和定位，以及利用定量技術(shù)（比如流式細胞儀）測定含量。

直接法

將標記的特異性熒光抗體，直接加在抗原標本上，經(jīng)一定的溫度和時間的染色，用水洗去未參加反應的多余熒光抗體，室溫下干燥后封片、鏡檢。

間接法

如檢查未知抗原，先用已知未標記的特異抗體（第一抗體）與抗原標本進行反應，用水洗去未反應的抗體，再用標記的抗抗體（第二抗體）與抗原標本反應，使之形成抗體—抗原—抗體復合物，再用水洗去未反應的標記抗體，干燥、封片后鏡檢。如果檢查未知抗體，則表明抗原標本是已知的，待檢血清為第一抗體，其它步驟的抗原檢查相同。

標記的抗抗體是抗球蛋白抗體，同于血清球蛋白有種的特異性，如免疫抗雞血清球蛋白只對雞的球蛋白發(fā)生反應，因此，制備標記抗體適用于任何抗原的診斷。

一、實驗步驟

免疫熒光實驗的主要步驟包括 樣片制備、固定及通透（或稱為透化）、封閉、抗體孵育、封片及熒光檢測等。

1、 樣品準備

對于單層生長細胞，在傳代培養(yǎng)時，將細胞接種到預先放置有處理過（70%乙醇中浸泡）的蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待細胞接近長成單層后取出蓋玻片即可，操作過程要小心，防止細胞脫片。

對于懸浮生長細胞，有兩種方式，一種是取對數(shù)生長細胞，制備細胞片或直接制備細胞涂片，把細胞片浸入封閉液中固定，封閉后滴加一抗和二抗孵育；另一種是先在懸浮液中進行固定和染色，離心洗脫后，用移液管移至盒式玻片進行后續(xù)抗體孵育。

對于冰凍切片制備，建議用新鮮組織，否則組織細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞，易使抗原彌散。組織一定要冷凍適度，切片時選用干凈鋒利的刀片，防止裂片和脫片。

對于石蠟切片的制備，要先進行脫蠟和抗原修復的處理。

2、固定

做好切片并風干后立即用合適的固定液（固定液包括有機溶劑和交聯(lián)劑，其選擇取決于抗原的性質(zhì)及所用抗體的特性）進行固定，尤其要較長時間保存的白片，一定要及時固定和適當保存。

固定時間則取決于固定組織切片的大小和類型，對大多數(shù)組織，18-24h即可，而細胞的固定時間較短。

3、通透

針對胞內(nèi)抗原，使用0.5% Triton X-100或丙酮等通透劑進行通透，這一步的目的是使抗體進入胞內(nèi)。

4、封閉

為防止內(nèi)源性非特異性蛋白抗原的結(jié)合，需要在一抗孵育前先用封閉液（一般包括與二抗同一來源的血清、BSA或者羊血清）封閉，減弱背景著色。封閉開始后，要注意樣品的保濕，避免樣品干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景。

5、一抗孵育

一抗孵育溫度一般分為：4℃、室溫、37℃，其中4℃效果更佳；孵育時間與溫度、抗體濃度有關(guān)，一般37℃孵育1-2h，4℃過夜（從冰箱拿出后37℃復溫45min）。具體條件還要根據(jù)樣品、稀釋液等條件進行摸索嘗試。

6、熒光二抗孵育

熒光二抗孵育一般在室溫或37℃孵育30min-1h，該過程必須在避光環(huán)境下進行，防止熒光淬滅。熒光素標記的二抗隨著保存時間的延長，可能會有大量的游離熒光素殘留，需要注意配制時采用小包裝并進行適當?shù)碾x心。

7、復染

一般采用DAPI進行復染，目的是形成細胞輪廓，從而更好地對目標蛋白進行定位。

8、封片

為了長期保存，我們需要對樣本進行封片，用吸水紙吸干爬片上的液體，一般用緩沖甘油等或?qū)ｉT的抗熒光淬滅的封片液。

9、 熒光觀察

有條件的話最好立即用熒光顯微鏡觀察拍照，若不能及時拍照，也要做好封片和封固，保持避光和濕度。熒光顯微鏡的成像能力對最終的結(jié)果也會造成很大的影響，好的熒光顯微鏡能夠最大限度地收集熒光信號，并呈現(xiàn)高分辨率的圖片，使細節(jié)更清楚，更易得到一張效果極佳的結(jié)果圖。

注意：

切片清洗：為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，所以適當?shù)丶訌娗逑?延長時間和增多次數(shù))尤為重要，一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均為5次*5min。

(1)單獨沖洗，防止交叉反應造成污染；

(2)溫柔沖洗，防止切片的脫落�？墒褂媒�洗方式；

(3)沖洗的時間要足夠，才能徹底洗去結(jié)合的物質(zhì)；

(4)PBS的PH和離子強度的使用和要求（建議PH在7.4-7.6，濃度是0.01M；中性及弱堿性條件有利于免疫復合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強度有利于免疫復合物的形成，而高離子強度則有利于分解）。

根據(jù)上述步驟完成免疫熒光實驗后，就需要進行熒光顯微成像，得到我們想要的結(jié)果。選擇一款操作簡單、成像清晰、效果卓越的熒光顯微鏡進行觀察拍照，才能輕松得到更為理想的結(jié)果圖，達到事半功倍的效果。

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