利用磷酸化組和代謝組揭示膿毒癥中EGFR胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制

 

研究材料
 

CLP誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠模型、BMDM和RAW264.7巨噬細(xì)胞、臨床急性膿毒癥患者中的巨噬細(xì)胞
 

技術(shù)路線(xiàn)
 

步驟1：LPS促進(jìn)巨噬細(xì)胞表面EGFR的激活和表達(dá)；

步驟2：EGFR/MAPK14/Rab7a（S72）調(diào)節(jié)晚期EGFR內(nèi)吞；

步驟3：Rab5a介導(dǎo)EGFR在巨噬細(xì)胞中的早期內(nèi)化；

步驟4：Rab10促進(jìn)EGFR從高爾基體運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞表面；

步驟5：抑制EGFR磷酸化可抑制巨噬細(xì)胞中M1極化、通過(guò)激活PPARγ調(diào)節(jié)谷氨酰胺代謝促進(jìn)M2極化；

步驟6：抑制EGFR磷酸化可使M1表型轉(zhuǎn)變?yōu)镸2表型，減輕膿毒癥引起的急性肺損傷。

 

研究結(jié)果
 

1.  LPS促進(jìn)巨噬細(xì)胞表面EGFR的激活和表達(dá)

本研究發(fā)現(xiàn)在BMDM和RAW264.7兩種巨噬細(xì)胞中證實(shí)LPS均可激活EGFR的細(xì)胞表面的表達(dá)（圖1A-1F）。在CLP(盲腸結(jié)扎穿刺)誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠模型和臨床急性膿毒癥患者中，巨噬細(xì)胞表面的EGFR的表達(dá)量均較正常組明顯升高(圖1G-1K)。綜上所述，LPS誘導(dǎo)膿毒癥巨噬細(xì)胞表面EGFR的激活，并促進(jìn)EGFR的表達(dá)。
 

圖1 LPS促進(jìn)巨噬細(xì)胞表面EGFR的表達(dá)LPS促進(jìn)巨噬細(xì)胞表面EGFR的表達(dá)

 

2. Rab7a的S72磷酸化促進(jìn)晚期EGFR內(nèi)吞

抑制EGFR磷酸化顯著降低了巨噬細(xì)胞膜中EGFR的表達(dá)，提示EGFR激酶活性在受體運(yùn)輸中起重要作用。為了發(fā)現(xiàn)EGFR激酶新的下游靶點(diǎn)，作者采用定量磷酸化修飾蛋白組學(xué)的方法對(duì)RAW264.7細(xì)胞進(jìn)行分析(對(duì)照組、LPS處理組、EGFR抑制劑（PD168393）+LPS共同處理組)。總共分析了11772個(gè)獨(dú)特的磷酸位點(diǎn)，對(duì)應(yīng)了8151個(gè)肽片段、3041個(gè)獨(dú)特的蛋白質(zhì)。磷酸化修飾組學(xué)中的KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)磷酸化肽主要富集于MAPK信號(hào)通路、內(nèi)吞和糖酵解通路（圖2B）。在差異的磷酸化肽段中，只有Rab7a被報(bào)道參與了細(xì)胞內(nèi)吞通路，Rab7a GTPase參與調(diào)節(jié)胞吞介導(dǎo)的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)，特別是Rab7A促進(jìn)了生長(zhǎng)因子受體等膜受體從早期核內(nèi)體到晚期核內(nèi)體和溶酶體的運(yùn)輸，因此作者重點(diǎn)研究了RAB7a磷酸化與EGFR轉(zhuǎn)運(yùn)之間的關(guān)系。修飾組學(xué)發(fā)現(xiàn)Rab7a在S72位發(fā)生磷酸化修飾（圖2C-2D）（經(jīng)WB和點(diǎn)突變、模擬突變方式證實(shí)RAB7a在S72發(fā)生了磷酸化修飾（圖3A-3D））。為研究S72磷酸化對(duì)Rab7a的GTPase活性的影響，作者分析了LPS處理的巨噬細(xì)胞中， Rab7a與CD63(晚期核內(nèi)體)、LAMP1(自噬體成熟階段相關(guān)蛋白)的共定位（圖3E-3J），結(jié)果表明Rab7a磷酸化調(diào)節(jié)了EGFR的后期內(nèi)吞降解，從而影響了EGFR的膜表達(dá)。

圖2 磷酸化修飾組學(xué)KEGG通路和差異表達(dá)肽段分析

圖3 Rab7a的S72磷酸化促進(jìn)晚期EGFR內(nèi)吞
 

3.  MAPK14磷酸化Rab7a的S72位點(diǎn)

根據(jù)磷酸化修飾組學(xué)的結(jié)果，作者推測(cè)Rab7a的S72磷酸化是受EGFR/MAPK14通路影響的。作者通過(guò)共定位（圖4A）以及體外、體內(nèi)（加入MAPK14抑制劑）共沉淀(圖4B-4E)和MAPK14/ Rab7a-S72點(diǎn)突變(圖4G)的方式證實(shí)了MAPK14可以直接結(jié)合并磷酸化Rab7a，Rab7a S72是MAPK14磷酸化的主要位點(diǎn)。為了了解MAPK14介導(dǎo)的Rab7a磷酸化在EGFR細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控中的作用，作者分析了MAPK14敲除和CD63、LAMP1的共定位（圖4D-4O），結(jié)果表明MAPK14介導(dǎo)的Rab7a磷酸化調(diào)控了LPS激活的巨噬細(xì)胞的晚期內(nèi)吞和EGFR降解。

圖4 MAPK14磷酸化Rab7a的S72位點(diǎn)

 

4. Rab5a介導(dǎo)EGFR在巨噬細(xì)胞中的早期內(nèi)化

生長(zhǎng)因子受體的內(nèi)吞轉(zhuǎn)運(yùn)是EGFR信號(hào)通路時(shí)空調(diào)控的重要細(xì)胞機(jī)制之一。研究發(fā)現(xiàn)LPS處理巨噬細(xì)胞1小時(shí)后，PD168393預(yù)處理組中早期核內(nèi)體(EEA1)和EGFR之間的共定位減弱。由于Rab5a是細(xì)胞內(nèi)吞作用的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，作者將Rab5a與EGFR進(jìn)行了免疫共沉淀和免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)了兩者的共定位。隨后通過(guò)Rab5a的敲除以及其效應(yīng)蛋白抑制劑的添加、Rab5a敲除小鼠的驗(yàn)證，證實(shí)LPS誘導(dǎo)的EGFR早期內(nèi)化是由Rab5a介導(dǎo)的（圖5）。

圖5 Rab5a介導(dǎo)EGFR在巨噬細(xì)胞中的早期內(nèi)化

 

5. Rab10促進(jìn)EGFR從高爾基體運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞表面

為了尋找EGFR細(xì)胞表面表達(dá)的細(xì)胞調(diào)控機(jī)制，作者將重點(diǎn)放在Ras家族的小g蛋白上。Rab10主要參與蛋白質(zhì)從高爾基體到質(zhì)膜的運(yùn)輸。作者發(fā)現(xiàn)Rab10定位于高爾基體和EEA1，但不定位于晚期核內(nèi)體。同時(shí)，Rab10和EGFR共定位。此外，Rab10沉默的巨噬細(xì)胞表面EGFR表達(dá)明顯降低(圖6A-6G)。隨后通過(guò)構(gòu)建Rab10的突變細(xì)胞系及EGFR的表面表達(dá)，證實(shí)Rab10促進(jìn)EGFR從高爾基體運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞表面（圖6H-6M）。

圖6 Rab10促進(jìn)EGFR從高爾基體運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞表面

 

6. 抑制EGFR磷酸化可抑制巨噬細(xì)胞中糖酵解依賴(lài)性M1極化

為了評(píng)估細(xì)胞膜EGFR激活對(duì)膿毒癥巨噬細(xì)胞M1/M2表型平衡的影響，作者使用LPS刺激BMDMs和RAW264.7兩種巨噬細(xì)胞向M1表型轉(zhuǎn)變。研究發(fā)現(xiàn)PD168393處理和Erlotinib處理（EGFR抑制劑）均顯著下調(diào)了M1標(biāo)志物iNOS的表達(dá)水平，即表明細(xì)胞表面的EGFR磷酸化促進(jìn)內(nèi)毒素血癥或敗血癥相關(guān)的M1巨噬細(xì)胞的激活。為了進(jìn)一步闡明EGFR對(duì)內(nèi)毒素血癥代謝的影響，作者開(kāi)展了代謝組學(xué)分析，結(jié)果表明LPS組磷酸戊糖通路(PPP)和糖酵解中間產(chǎn)物增加、PD168393的處理降低HIF-1ɑ和乳酸脫氫酶A (LDHA)蛋白表達(dá)。綜上所述，抑制EGFR磷酸化可以減少巨噬細(xì)胞對(duì)LPS的糖酵解反應(yīng)（圖7）。

圖7 抑制EGFR磷酸化可抑制巨噬細(xì)胞中糖酵解依賴(lài)性M1極化

 

7. 抑制EGFR磷酸化通過(guò)激活PPARγ調(diào)節(jié)谷氨酰胺代謝促進(jìn)M2極化

作者接進(jìn)一步研究了EGFR磷酸化在M2表型極化中的作用，結(jié)果表明Erlotinib處理后，M2標(biāo)志物CD206在細(xì)胞和小鼠體內(nèi)均顯著增加，即意味著抑制EGFR磷酸化促進(jìn)膿毒癥期間M2巨噬細(xì)胞極化（圖8A-8J）。PPARγ控制巨噬細(xì)胞谷氨酰胺代謝，在M2極化和代謝之間提供聯(lián)系，而M2極化需要谷氨酰胺。代謝組學(xué)分析表明，PD168393處理后谷氨酰胺水平升高，且PD168393顯著促進(jìn)了PPARγ的激活，CD206的表達(dá)隨著PPARγ的激活而增加(圖8J-8K)。綜上所述，抑制EGFR磷酸化通過(guò)激活PPARγ調(diào)節(jié)谷氨酰胺代謝從而促進(jìn)M2極化。

圖8 抑制EGFR磷酸化通過(guò)激活PPARγ調(diào)節(jié)谷氨酰胺代謝促進(jìn)M2極化

 

8. 抑制EGFR磷酸化可使M1表型轉(zhuǎn)變?yōu)镸2表型，減輕膿毒癥引起的急性肺損傷

為了進(jìn)一步驗(yàn)證EGFR抑制劑在體內(nèi)對(duì)炎癥和巨噬細(xì)胞極化的影響，應(yīng)用LPS和CLP誘導(dǎo)的急性肺損傷(ALI)小鼠模型發(fā)現(xiàn)，在給予Erlotini的小鼠中，M2標(biāo)志物CD206的表達(dá)增加，而M1標(biāo)志物iNOS的表達(dá)減少。此外，Erlotini明顯減少了中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)減弱了炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、間質(zhì)水腫和肺泡間隔增厚。綜上表明，EGFR抑制劑可能通過(guò)調(diào)節(jié)體內(nèi)巨噬細(xì)胞極化和減少炎癥來(lái)改善膿毒性（圖9）。

圖9 抑制EGFR磷酸化可使M1表型轉(zhuǎn)變?yōu)镸2表型，減輕膿毒癥引起的急性肺損傷

 

 小編小結(jié)

該研究發(fā)現(xiàn)在LPS作用下，巨噬細(xì)胞表面EGFR的表達(dá)增強(qiáng)。然后通過(guò)磷酸化修飾組和代謝組學(xué)等方法揭示了EGFR的整個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，包括質(zhì)膜易位、早期內(nèi)化和晚期內(nèi)吞，以及調(diào)控這些過(guò)程的特異性Rab蛋白的分子機(jī)制。此外，作者還發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表面EGFR水平調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞M1/M2極化表型轉(zhuǎn)化，并通過(guò)代謝重編程影響膿毒癥誘導(dǎo)的多器官損傷。該研究為EGFR作為膿毒癥治療的潛在靶點(diǎn)提供了有力的證據(jù)。