為什么癌癥早期診斷離不開單EV分析？

INTRODUCTION

某個(gè)患者的癌癥會(huì)持續(xù)發(fā)展直至轉(zhuǎn)移嗎？這是基礎(chǔ)保健、腫瘤學(xué)、預(yù)防醫(yī)學(xué)、流行病學(xué)以及醫(yī)療保健系統(tǒng)持續(xù)關(guān)注的問題。這一問題需要具有高度靈敏和特異性的同時(shí)且低成本的“液體活檢”技術(shù)來解決。腫瘤在其生長過程中釋放到循環(huán)系統(tǒng)中的多種成分就成為了解決這一問題的突破口，其主要包括循環(huán)腫瘤細(xì)胞及其團(tuán)簇、ctDNA、EVs、蛋白質(zhì)等。

癌癥早期診斷的關(guān)鍵問題是：哪種血液成分最適合檢測；某一個(gè)標(biāo)志物的含量（罕見或超罕見）；對于特定的癌癥，包括癌癥發(fā)生的位置，這個(gè)標(biāo)志物有多獨(dú)特？

1.為什么是EV而不是CTC或者ctDNA

EVs的優(yōu)勢首先在于其含量豐富，腫瘤細(xì)胞在生長過程中可持續(xù)不斷地分泌EVs并進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，且因其代謝速率高導(dǎo)致EV的產(chǎn)量也遠(yuǎn)高于正常細(xì)胞。此外，相比于ctDNA的生成依賴于腫瘤細(xì)胞的死亡，EVs由活細(xì)胞所產(chǎn)生，它的產(chǎn)生更像是一個(gè)持續(xù)發(fā)生的事件，可以實(shí)時(shí)反映腫瘤發(fā)展的進(jìn)程。例如，在晚期黑色素瘤中，含有突變等位基因BRAFV600E和cKITD816V的DNA更多與EVs之間并無相關(guān)性，但并不能據(jù)此判斷為早期黑色素瘤；而另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)了exoDNA和ctDNA之間具有很好的相關(guān)性，但exoDNA的KRAS突變的存在與新輔助治療后的疾病進(jìn)展緊密相關(guān)。此外，EVs的磷脂雙層膜結(jié)構(gòu)可有效保護(hù)其所運(yùn)載的RNA和蛋白質(zhì)，避免其在循環(huán)系統(tǒng)中的降解，使得RNA和蛋白可被用于腫瘤的“液體活檢”。

圖1. 液體活檢在癌癥分析中的作用

2.為什么要進(jìn)行單EV分析？

現(xiàn)有的文獻(xiàn)模型通常認(rèn)為外泌體以及其它EVs包含有大量的蛋白質(zhì)和核酸。這些觀點(diǎn)大多數(shù)基于不考慮異質(zhì)性的前提下，對一群EVs選用的集權(quán)平均的分析方法獲得的結(jié)果。隨著EV研究的深入，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)單個(gè)EVs上的蛋白質(zhì)和核酸遠(yuǎn)沒有那么豐富，只有很小一部分EVs含有腫瘤特異的標(biāo)志物，如突變的蛋白質(zhì)等（圖2）。那如何在循環(huán)系統(tǒng)這一EVs的汪洋中檢測出這部分高度特異但是稀有的ctEVs？此外，高度的異質(zhì)性是EVs的主要特征之一，即使來源于同一個(gè)細(xì)胞的EVs之間也是千差萬別，且腫瘤群體中的細(xì)胞本就具有極大的多樣性�；�于以上因素，EVs的單顆粒水平分析就成為了基于EVs的“液體活檢”的必經(jīng)之路。

圖2. EV的組成

單個(gè)EV分析技術(shù)的優(yōu)勢之一就是能夠揭示EVs的異質(zhì)性，并將EV蛋白、核酸組成與親代細(xì)胞的組成進(jìn)行比較。在單個(gè)EVs水平，蛋白標(biāo)志物的含量比mRNA以及DNA生物標(biāo)志物的含量高很多，且這些腫瘤相關(guān)標(biāo)志蛋白可被抗體簡單有效識(shí)別。最近，來自麻省總院的Weissleder教授團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)即使幾乎所有的ASPC1細(xì)胞（人轉(zhuǎn)移胰腺癌細(xì)胞系）均表現(xiàn)為KRASmut，P53mut或者其他生物標(biāo)志物（MUC1，EGFR或FG-P4OH等）陽性，但其所產(chǎn)生的EVs也僅有40%表現(xiàn)出KRASG12D陽性或P53mut陽性。類似的現(xiàn)象在其它胰腺癌細(xì)胞系中也均有發(fā)現(xiàn)，即從細(xì)胞上清中收獲的EVs中大約40-50%沒有相關(guān)腫瘤標(biāo)志物的表達(dá)。

人血液中的ctEV被其他細(xì)胞衍生的EVs進(jìn)一步稀釋了，那血液中ctEV的豐度和異質(zhì)性如何呢？有模型計(jì)算得出，人體內(nèi)的腫瘤每增大1 mm3，每毫升血液中相應(yīng)地會(huì)增加23-1900個(gè)ctEVs。即使是分泌速度最慢的腫瘤細(xì)胞，其所釋放EVs的速度也比非腫瘤細(xì)胞高至少一個(gè)數(shù)量級。這個(gè)結(jié)果與很多文獻(xiàn)報(bào)道的發(fā)現(xiàn)吻合，在晚期腫瘤患者體內(nèi)，均發(fā)現(xiàn)循環(huán)囊泡的數(shù)量成倍增加。因此，一種靈敏的檢測方法，如果能在1 mL血液中檢測出小于1 mm3的腫瘤，將有望把癌癥早期檢測和監(jiān)控提前幾年甚至十幾年。可惜目前絕大多數(shù)的分析技術(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到這么高的靈敏度。由于非特異性的背景信號占據(jù)主導(dǎo)和并非所有的ctEVs的癌癥特異標(biāo)志物都是陽性的這兩大原因，傳統(tǒng)的集權(quán)平均的方法，如WB和ELISA等，能夠測到小于1 cm3的腫瘤的概率微乎其微。而新型單囊泡分析技術(shù)在這一領(lǐng)域則被寄予厚望。

3.單個(gè)EV分析技術(shù)

針對EVs的集權(quán)平均分析方法的相關(guān)綜述屢見不鮮，而利用EVs真正實(shí)現(xiàn)癌癥早期診斷的報(bào)導(dǎo)則屈指可數(shù)。近5年才開始陸續(xù)出現(xiàn)能夠?qū)崿F(xiàn)單個(gè)EV的表型分析的方法，其中大多數(shù)方法利用熒光傳感，光散射或者電子吸收等原理。典型的研究型方法包括透射電鏡，冷凍電鏡，原子力顯微鏡，超分辨熒光顯微鏡，全內(nèi)反射熒光顯微鏡，拉曼光譜等，而這些方法往往伴隨著需要比較多的操作時(shí)間、貴重的儀器設(shè)備以及專業(yè)的操作技能，通量低等局限性。

經(jīng)過多年的持續(xù)發(fā)展，在臨床環(huán)境中實(shí)現(xiàn)單EV分析并且具有診斷前景的技術(shù)已經(jīng)出現(xiàn)，主要圍繞分離或者傳感等需求。這些方法在準(zhǔn)確度、復(fù)雜程度、診斷時(shí)長以及每個(gè)樣品的花費(fèi)方面均有差異。其中，無偏見單EV分析已經(jīng)成功應(yīng)用于幾種癌癥類型的診斷，包括結(jié)直腸癌、前列腺癌、乳腺癌、宮頸癌、黑色素瘤以及胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）等。

需要特別指出的是，納米流式檢測技術(shù)（NanoFCM）是一個(gè)備受關(guān)注并被寄予厚望的技術(shù)領(lǐng)域，有可能實(shí)現(xiàn)快速高通量、自動(dòng)化和規(guī)�；�。

早在2018年，就有學(xué)者利用納米流式檢測技術(shù)在單EV水平實(shí)現(xiàn)了結(jié)直腸癌的早期診斷。今年廈門大學(xué)的科研團(tuán)隊(duì)基于EVs發(fā)展了鼻咽癌的早期診斷方法，AUC可達(dá)1.000，該方法同時(shí)可實(shí)現(xiàn)鼻咽癌和鼻咽炎的區(qū)分。(廈大團(tuán)隊(duì)揭秘如何通過EVs區(qū)分癌癥和炎癥)

4.如何分離純化EVs?

從復(fù)雜的體液環(huán)境中獲得高純度的EVs，一直是EV研究和臨床應(yīng)用中亟需突破的重要瓶頸。目前市面上的EV分離方法，所需的時(shí)間和獲得EV的純度都有差異。務(wù)實(shí)地說，方法的選擇取決于要解決的是臨床前還是臨床的問題。超速離心（密度梯度離心）是EV分離最經(jīng)典的方法，但耗時(shí)長和回收率低是一直被詬病的問題。一些更快速的方法，如聚合物沉淀、免疫捕獲以及超濾、尺寸排阻色譜等也可以提供EV分離的方案，它們各自有獨(dú)特的優(yōu)勢和局限性。

不管選用什么分離純化方法，都需要進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制確保EV的富集效率和純度，檢測一些指標(biāo)：合理的尺寸和電性；可控的凋亡小體、脂蛋白或者其他蛋白團(tuán)聚體的干擾。

在早期的推文中，小編詳細(xì)介紹過血漿來源EVs的常見分離純化方法對比（做外泌體，我的純化方法靠譜嗎？如何質(zhì)控？）以及不同來源的EVs的分離純化方法的比較分析（外泌體分離純化方法——適合自己的才是最好的！），感興趣的小伙伴們可以回顧一下。

5.EV進(jìn)入臨床診斷的難點(diǎn)？
目前基于EV的發(fā)現(xiàn)研究絕大多數(shù)基于集權(quán)平均的分析方法，且鮮有驗(yàn)證研究的報(bào)道。一種方法能否進(jìn)入臨床，有一些先決條件：
（1）處理小體積血漿的能力
（2）速度快且高通量
（3）自動(dòng)化和規(guī)�；�
（4）重現(xiàn)性
（5）合理的花費(fèi)

單EV分析中的大多數(shù)技術(shù)挑戰(zhàn)已經(jīng)被攻克，但仍然存在一些重要挑戰(zhàn)。這其中包括需要更深層次的分析手段來：
（i）鑒別良性和惡性EVs
（ii）確定循環(huán)腫瘤衍生的EVs（ctEVs）的器官來源
（iii）更好的理解不同癌癥中EVs的異質(zhì)性
（iv）發(fā)現(xiàn)新的有潛力的EV生物標(biāo)志物
缺乏嚴(yán)格、控制良好的臨床研究是其中一個(gè)尤為重大的挑戰(zhàn)。
早期診斷對于腫瘤的干預(yù)和治療的重要性是毋庸置疑的。單個(gè)EV的分析將探索和闡明循環(huán)EVs帶入到一個(gè)令人興奮的新研究領(lǐng)域，希望其作為新興的臨床分析方法可以用于各種不同惡性腫瘤的早期篩查。

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