ZIP1缺陷型小鼠在揭秘肺癌的化療耐藥性研究中的應(yīng)用

肺癌是造成全球癌癥死亡的主要原因�；瘜W(xué)療法、放射療法、靶向生物療法以及近年來的免疫療法是肺癌患者的主要治療選擇，但腫瘤與基質(zhì)成纖維細(xì)胞間的某些相互作用會引起肺癌的化療耐藥性，導(dǎo)致癌癥復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。因此，了解成纖維細(xì)胞與腫瘤之間的通訊無疑將有助于肺癌治療的改善。

近日，鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心的研究團隊發(fā)現(xiàn)，鋅轉(zhuǎn)運蛋白ZIP1陽性（ZIP1⁺）的成纖維細(xì)胞通過間隙連接直接與腫瘤細(xì)胞相互作用，并導(dǎo)致肺癌化療耐藥。這項研究成果于10月7日發(fā)表在《Nature Communications》雜志上，對肺癌化療的改善具有重要意義。

圖片來源：Nature Communications

（https://www.nature.com/articles/s41467-022-33521-4）

研究材料與方法
在這項研究中，研究人員使用了小鼠肺癌細(xì)胞系LLC和人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和H1299，并分離了人癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（hCAF），同時也使用了ZIP1缺陷型小鼠（由賽業(yè)生物提供）和異位移植小鼠腫瘤模型。此外，作者采用單細(xì)胞RNA測序?qū)�基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行分選，并開展了基因集變異分析（GSVA）和RNA速率分析，最后通過FACS測定了細(xì)胞內(nèi)的Zn²⁺，以及Zn²⁺的吸收和轉(zhuǎn)移。

技術(shù)路線

01 通過scRNA-seq分析CAF在化療后的適應(yīng)性，發(fā)現(xiàn)Zip1在一個亞群在高水平表達(dá)

02 分析ZIP1的表達(dá)是否影響間隙連接的形成，發(fā)現(xiàn)ZIP1⁺ CAF與肺癌細(xì)胞形成間隙連接

03 ZIP1⁺成纖維細(xì)胞作為Zn²⁺儲備庫，通過間隙連接將Zn²⁺轉(zhuǎn)移至癌細(xì)胞中

04 Zn²⁺誘導(dǎo)ABCB1介導(dǎo)的藥物排出，促進(jìn)肺癌的化療耐藥

05 ZIP1⁺成纖維細(xì)胞與肺癌患者的化療耐藥具有臨床相關(guān)性

研究結(jié)果
1.ZIP1⁺成纖維細(xì)胞與肺癌細(xì)胞形成間隙連接
癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（Cancer-associated fibroblasts, CAF）是異質(zhì)性的基質(zhì)細(xì)胞，與肺癌化療耐藥有關(guān)。之前的研究發(fā)現(xiàn)，成纖維細(xì)胞可以直接與腫瘤細(xì)胞連接，導(dǎo)致其轉(zhuǎn)移。還有報道稱，CAF可能與肺癌細(xì)胞形成間隙連接（gap junction），以交換代謝物。然而，在化療過程中，間隙連接如何調(diào)控成纖維細(xì)胞與癌細(xì)胞之間的通訊，目前還不大清楚。

在這項研究中，研究人員使用異位移植小鼠腫瘤模型，通過單細(xì)胞RNA測序分析CAF在化療后的適應(yīng)性，發(fā)現(xiàn)了一個成纖維細(xì)胞亞群高水平表達(dá)Zip1。鋅轉(zhuǎn)運蛋白ZIP1是溶質(zhì)載體家族39（SLC39）中的一員，負(fù)責(zé)維持胞質(zhì)的鋅濃度。經(jīng)過化療藥物阿霉素（DOX）處理后，小鼠腫瘤中的Zip1⁺ CAF細(xì)胞增加，而其他CAF亞群減少（圖1）。
 

圖1 scRNA-seq顯示DOX處理后Zip1⁺ CAF細(xì)胞在腫瘤中富集^[1]

接下來，作者分析了ZIP1在成纖維細(xì)胞中的表達(dá)是否影響間隙連接蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，ZIP1在hCAF中的過表達(dá)增加了間隙連接蛋白43（CX43）的表達(dá)。相反，小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中Zip1的敲低則降低了CX43的表達(dá)。與Zip1^+/-和Zip1^-/-小鼠相比，Zip1^+/+小鼠也表達(dá)更高水平的CX43（實驗所用Zip1缺陷小鼠由賽業(yè)生物提供）。

后續(xù)的分析顯示，CAF上的CX43與腫瘤細(xì)胞中的CX43存在物理上的相互作用。熒光染料鈣黃綠素可從成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)移至腫瘤細(xì)胞，表明A549腫瘤細(xì)胞與hCAF之間形成功能性的間隙連接。在過表達(dá)ZIP1后，鈣黃綠素轉(zhuǎn)移更高效。這些結(jié)果表明，ZIP1⁺成纖維細(xì)胞通過上調(diào)CX43與腫瘤細(xì)胞形成有效的間隙連接。

2.ZIP1⁺成纖維細(xì)胞將Zn²⁺轉(zhuǎn)移至癌細(xì)胞
考慮到Zn²⁺是ZIP1的底物，研究人員接下來探討了在兩種細(xì)胞之間運輸Zn²⁺的可能性。結(jié)果顯示，在DOX處理后，腫瘤間隙液中不穩(wěn)定Zn²⁺水平增加，且在用DOX治療的腫瘤中觀察到大范圍的壞死。進(jìn)一步的分析顯示，CAF能夠吸收紫杉醇化療處理的垂死癌細(xì)胞釋放的Zn²⁺，并且吸收量與Zn²⁺的細(xì)胞外劑量成正比。此外，與hCAF共培養(yǎng)后，A549腫瘤細(xì)胞中的Zn²⁺增加，而庚醇（間隙連接的解偶聯(lián)劑）或TPEN（Zn²⁺螯合劑）的預(yù)處理可以降低Zn²⁺梯度（圖2）。研究人員認(rèn)為，ZIP1⁺成纖維細(xì)胞可作為Zn²⁺儲備庫，通過間隙連接將Zn²⁺轉(zhuǎn)移至癌細(xì)胞中。
 

圖2 ZIP1⁺成纖維細(xì)胞通過間隙連接將Zn²⁺轉(zhuǎn)移至癌細(xì)胞^[1]

在后續(xù)的分析中，作者發(fā)現(xiàn)CAF中的Zn²⁺以劑量依賴性方式刺激CX43的上調(diào)和pAKT的激活。同時，Zn²⁺刺激又導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞中的CX43表達(dá)以時間依賴性和劑量依賴性的方式升高。這些結(jié)果顯示，源于成纖維細(xì)胞的Zn²⁺通過上調(diào)癌細(xì)胞中的CX43進(jìn)一步促進(jìn)間隙連接的形成。

3.ZIP1⁺成纖維細(xì)胞促進(jìn)肺癌的化療耐藥
那么，Zn²⁺對于腫瘤對藥物的應(yīng)答有何影響？研究人員發(fā)現(xiàn)，肺癌細(xì)胞與CAF細(xì)胞的共培養(yǎng)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞表達(dá)ABCB1。ABCB1是一種多藥耐藥蛋白，可將多種藥物（包括DOX）排出細(xì)胞外，使得腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性。隨后用紫杉醇和TPEN聯(lián)合處理腫瘤細(xì)胞。在加入低水平的TPEN后，腫瘤對紫杉醇的敏感性顯著增加。同時，Zn²⁺刺激ABCB1表達(dá)并降低DOX在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的積累。由此可見，Zn²⁺誘導(dǎo)ABCB1介導(dǎo)的藥物排出，并保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受藥物毒性。

接下來，作者探討了ZIP1⁺成纖維細(xì)胞是否對癌細(xì)胞具有保護(hù)作用。與Zip1^-/-小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）相比，Zip1^+/+MEF減弱了DOX誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞的DNA損傷。相應(yīng)地，Zip1^+/+MEF降低了腫瘤細(xì)胞中的DOX，并增加了ABCB1的表達(dá)。對于荷瘤小鼠，DOX在Zip1^+/+小鼠腫瘤細(xì)胞內(nèi)的積累顯著低于Zip1^+/-和Zip1^-/-小鼠，而ABCB1在Zip1^+/+小鼠腫瘤細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)也顯著高于Zip1^-/-細(xì)胞。這些結(jié)果表明，無論在體外還是體內(nèi)，ZIP1在成纖維細(xì)胞中的表達(dá)都賦予了肺癌細(xì)胞耐藥性。

最后，研究人員在90名接受化療的肺腺癌患者隊列中進(jìn)一步研究了ZIP1⁺成纖維細(xì)胞與肺癌化療耐藥的臨床相關(guān)性。他們發(fā)現(xiàn)，在大多數(shù)腫瘤中，ZIP1⁺成纖維細(xì)胞的比例超過50%。此外，ZIP1^high成纖維細(xì)胞狀態(tài)預(yù)示著總生存期和無進(jìn)展生存期較差，表明ZIP1^high成纖維細(xì)胞與肺腺癌的化療耐藥性存在關(guān)聯(lián)。在另一組肺腺癌患者中，腫瘤細(xì)胞的ABCB1表達(dá)與CAF中的ZIP1表達(dá)呈正相關(guān)。這些結(jié)果都表明，ZIP1⁺成纖維細(xì)胞通過上調(diào)CX43與癌細(xì)胞相連接，并通過Zn²⁺轉(zhuǎn)移來促進(jìn)化療耐藥（圖3）。
 

研究結(jié)論
總的來說，這項研究顯示ZIP1⁺成纖維細(xì)胞與肺癌細(xì)胞之間通過CX43介導(dǎo)的間隙連接形成短距離的相互作用，并通過Zn²⁺轉(zhuǎn)移形成化療耐藥性。這些結(jié)果對肺癌治療具有重要意義，有望設(shè)計出克服化療耐藥性的策略。

原文檢索：
[1]Ni, C., Lou, X., Yao, X. et al. ZIP1⁺ fibroblasts protect lung cancer against chemotherapy via connexin-43 mediated intercellular Zn²⁺ transfer. Nat Commun 13, 5919 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-33521-4
 

ZIP1 KO小鼠
（Slc39a1 KO小鼠）

品系名稱：
C57BL/6N-Slc39a1^em1Cya

品系編號：
KOCMP-30791-Slc39a1-B6N-VA

產(chǎn)品編號：
S-KO-09070

應(yīng)用方向：
發(fā)育生物學(xué)，胚胎，增長/尺寸/體型，生理系統(tǒng)，分子生物學(xué)

打靶方案：

ZIP1 Flox小鼠
（Slc39a1 Flox小鼠）

品系名稱：
C57BL/6J-Slc39a1^em1(flox)Cya

品系編號：
CKOCMP-30791-Slc39a1-B6J-VA

產(chǎn)品編號：
S-CKO-10210

應(yīng)用方向：
發(fā)育生物學(xué)，胚胎，增長/尺寸/體型，生理系統(tǒng)，分子生物學(xué)

打靶方案：

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