轉(zhuǎn)錄+蛋白組分析揭示MUP1減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的作用

 

研究材料

小鼠肝臟組織、血清、尿液、小鼠原代肝細(xì)胞、AML12細(xì)胞、HepG2細(xì)胞

 技術(shù)路線

步驟1：在NAFLD小鼠模型中，肝組織中MUP蛋白顯著減少；

步驟2：在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下，肝細(xì)胞中MUP1蛋白表達(dá)和分泌減少；

步驟3：MUP1刺激肝細(xì)胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣流出并誘導(dǎo)急性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)；

步驟4：MUP1干預(yù)能夠引起肝細(xì)胞預(yù)適應(yīng)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，進(jìn)而緩解藥物引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的胰島素抵抗。

 研究結(jié)果

1.  NAFLD小鼠肝臟中MUP蛋白減少

生理指標(biāo)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)NAFLD小鼠表現(xiàn)出體重過度增加、肝臟與體重和脂肪與體重的比率增加，以及肝臟甘油三酯含量顯著增加。為了進(jìn)一步探討NAFLD小鼠肝臟內(nèi)蛋白質(zhì)的變化，作者采用了蛋白質(zhì)組學(xué)分析，結(jié)果顯示NAFLD小鼠的多種MUP亞型的顯著下降，其中MUP1亞型可能對代謝貢獻(xiàn)最大。這些數(shù)據(jù)表明MUPs，尤其是MUP1，可能是參與NAFLD代謝調(diào)節(jié)的重要因子。

圖1 NAFLD小鼠生理指標(biāo)及蛋白組檢測

2. NAFLD小鼠肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)受損

KEGG分析顯示，“內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工”途徑顯著豐富。NAFLD小鼠中，未折疊蛋白應(yīng)答（UPR）和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解（ERAD）途徑的表達(dá)模式發(fā)生了明顯改變。且WB結(jié)果顯示，在NAFLD小鼠的肝臟中，IRE1α和PERK的水平顯著增加，而p-eIF2α、ATF4和BiP的水平顯著降低，這表明在代謝紊亂和肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)中UPR信號失調(diào)導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負(fù)擔(dān)增加。這些數(shù)據(jù)表明，在NAFLD小鼠模型中，肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)受損 。  
 

圖2 NAFLD小鼠功能通路分析

 

3.  內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下肝細(xì)胞MUP1的表達(dá)降低

接下來，作者將NAFLD小鼠和對照小鼠腹腔注射衣霉素（Tm，一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑）或等量DMSO以建立肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激小鼠模型，蛋白質(zhì)檢測結(jié)果顯示MUPs的水平在肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型中顯著降低。WB分析證實(shí)了MUP1在肝臟中的類似表達(dá)模式。因此，MUPs被鑒定為代謝和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)蛋白，這表明MUPs可能是NAFLD中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和代謝的潛在聯(lián)系。

圖3 肝細(xì)胞中MUP的表達(dá)模式

 

4. 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中MUP1聚集

為了解決MUP1響應(yīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激而降低的機(jī)制，對肝臟切片進(jìn)行免疫熒光染色以確定MUP1在肝臟中的分布。共聚焦顯微鏡分析顯示，與對照小鼠相比，MUP1保留在Tm小鼠的肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。進(jìn)一步表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下MUP1在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的滯留增加，這部分解釋了細(xì)胞中成熟MUP1的減少。

圖4 MUP1在肝臟中的分布

 

5. MUP1刺激肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣離子外流并誘導(dǎo)急性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

用MUP1處理原代肝細(xì)胞并進(jìn)行RNA測序，GSEA分析顯示，“鈣信號通路”顯著富集（圖5B）。由于鈣穩(wěn)態(tài)對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞命運(yùn)至關(guān)重要，因此，作者推測MUP1作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)蛋白，可能通過反饋參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的調(diào)節(jié)。為了進(jìn)一步研究MUP1對肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響，用毒胡蘿卜素（thapsigargin，Tg）作為調(diào)節(jié)Ca²⁺濃度的陽性對照。結(jié)果顯示，MUP1處理瞬時(shí)刺激內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑。值得注意的是，MUP1對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響與Tg相似，表明MUP1對Ca²⁺穩(wěn)態(tài)的潛在作用。而在無Ca²⁺溶劑中用MUP1處理，Ca²⁺從ER流出，顯著增加了胞漿Ca²⁺濃度。這些數(shù)據(jù)表明，MUP1刺激肝細(xì)胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子外流并誘導(dǎo)急性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。
 

圖4 MUP1在肝臟中的分布

 

5. MUP1刺激肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣離子外流并誘導(dǎo)急性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

用MUP1處理原代肝細(xì)胞并進(jìn)行RNA測序，GSEA分析顯示，“鈣信號通路”顯著富集（圖5B）。由于鈣穩(wěn)態(tài)對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞命運(yùn)至關(guān)重要，因此，作者推測MUP1作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)蛋白，可能通過反饋參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的調(diào)節(jié)。為了進(jìn)一步研究MUP1對肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響，用毒胡蘿卜素（thapsigargin，Tg）作為調(diào)節(jié)Ca²⁺濃度的陽性對照。結(jié)果顯示，MUP1處理瞬時(shí)刺激內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑。值得注意的是，MUP1對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響與Tg相似，表明MUP1對Ca²⁺穩(wěn)態(tài)的潛在作用。而在無Ca²⁺溶劑中用MUP1處理，Ca²⁺從ER流出，顯著增加了胞漿Ca²⁺濃度。這些數(shù)據(jù)表明，MUP1刺激肝細(xì)胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子外流并誘導(dǎo)急性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。

圖5 MUP1對肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響

 

6. MUP1預(yù)處理抑制蛋白質(zhì)合成并減輕肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和胰島素抵抗

為了進(jìn)一步研究MUP1在短暫刺激內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的生理意義，將原代肝細(xì)胞用MUP1預(yù)處理后用Tm處理誘導(dǎo)應(yīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。WB和轉(zhuǎn)錄組結(jié)果表明，Tm顯著增加了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物的蛋白質(zhì)水平，包括GADD34、ATF4、CHOP、XBP1s和p-eIF2α，而MUP1預(yù)處理可抑制ER應(yīng)激。接下來，作者評估了抑制肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對胰島素反應(yīng)的影響。MUP1預(yù)處理細(xì)胞受到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，Akt顯著增強(qiáng)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)記物顯著減弱，這表明胰島素敏感性和肝內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激得到改善。該數(shù)據(jù)表明，MUP1預(yù)處理在體外減輕了肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的胰島素抵抗。

圖6 MUP1預(yù)處理減輕了肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和胰島素抵抗

7. MUP1預(yù)處理減輕Tm誘導(dǎo)的肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

為了評估MUP1在體內(nèi)的病理生理作用，用MUP1預(yù)處理小鼠然后腹腔注射Tm以建立急性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型，Tm處理導(dǎo)致明顯的肝臟甘油三酯積聚和空泡化，MUP1預(yù)處理組有所改善，結(jié)果表明MUP1預(yù)處理減輕了Tm誘導(dǎo)的過度肝臟脂肪變性。同時(shí)，作者還研究了腎臟中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。有趣的是，MUP1預(yù)處理顯著減輕了Tm誘導(dǎo)的腎內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，這表明MUP1對體內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的影響 。

圖7 MUP1在體內(nèi)的病理生理作用

 
小編小結(jié)

在這項(xiàng)研究中，作者提供了肝臟MUPs顯著降低導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激受損的證據(jù)。MUP1作為MUP家族中最豐富的成員，由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成和加工，它受到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的負(fù)調(diào)節(jié)。從機(jī)制上講，肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致MUP1形成聚集體并被困在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，從而減少M(fèi)UP1的分泌。此外，在肝細(xì)胞中補(bǔ)充重組MUP1增加了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子外流至胞漿中，并短暫誘導(dǎo)預(yù)適應(yīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，這有助于肝細(xì)胞通過抑制蛋白質(zhì)合成來減輕化學(xué)誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的胰島素抵抗，表明NAFLD的潛在治療靶點(diǎn)。