原生質(zhì)體葉肉細(xì)胞瞬時表達(dá)實驗方法及步驟

原生質(zhì)體葉肉細(xì)胞瞬時表達(dá)
1、 生長培養(yǎng)好的試驗材料（一般為生長20天左右的擬南芥幼苗葉片）
2、 在擬南芥開花前取樣（30片葉子左右即可）
3、 切取葉片為0.5-1mm的細(xì)條（如果材料能達(dá)到每克10⁷個原生質(zhì)體， 10-20片葉子需要5-10mL酶解液）
4、 迅速將切下的樣品轉(zhuǎn)到酶解液中，要求完全浸沒。
5、 黑暗條件下抽真空30min。
6、 連續(xù)酶解，室溫下23℃黑暗中靜止酶解3h
7、 利用光學(xué)顯微鏡檢查原生質(zhì)體（30-50μm大小）
8、 在過濾前加入等量的W5溶液
9、 洗干凈濾網(wǎng)，并用W5潤濕，之后過濾
10、 離心100g，1-2min沉淀原生質(zhì)體，盡可能吸走上清，重復(fù)洗2 次
11、 重懸原生質(zhì)體于W5中，保持在2*10⁵個 /ml，冰浴30min。
12、 100g離心2min，盡可能吸走上清，利用MMG重懸，濃度約 2*10⁵個/ml
13、 加入10μL質(zhì)粒（1000ng-2000ng ）于2ml離心管中
14、 加入100μL原生質(zhì)體（2*10⁴個），輕輕混勻。
15、 加110μL PEG solution，輕彈使充分混勻
16、 23℃室溫孵育30min。
17、 加400-440μL W5混勻，終止反應(yīng)
18、 100g，2min 23℃離心，去上清，重復(fù)洗一次
19、 用1mL W5重懸原生質(zhì)體并放入6孔板中培養(yǎng)
20、 20-25℃孵育16h以上
21、 取樣制片觀察

溶液配制：
1、 酶解液的配制（20ml）
 

試劑	終濃度	質(zhì)量/g
MES	20mM	0.08528	KOH調(diào)pH5.7
D-Mannitol	0.4M	1.45736
KCl	20mM	0.02982
macerozyme R-10	0.40%	0.08
Cellulase R-10	1.50%	0.3
55℃水浴10min，待冷卻后再加以下試劑
CaCl2·2H2O	10mM	0.029402
BSA	0.10%	0.02
W5溶液配制（500mL）
試劑	終濃度	質(zhì)量/g
MES	2mM	0.19524	KOH調(diào)pH5.7
NaCl	154mM	4.49988
CaCl2·2H2O	125mM	9.18825
KCl	5mM	0.186375
MMG配制（100mL）
試劑	終濃度	質(zhì)量/g
MES	4mM	0.078096	KOH調(diào)pH5.7
D-Mannitol	0.4M	7.2868
MgCl2·6H2O	15mM	0.30495
PEG配制（10mL）
試劑	終濃度	質(zhì)量/g
PEG 4000	40%	4
D-Mannitol	0.2M	0.36434
CaCl2·2H2O	100mM	0.14701