足細(xì)胞特異性表達(dá)B7-1轉(zhuǎn)基因小鼠在發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞損傷的重要機(jī)制中的應(yīng)用

慢性腎臟病（Chronic Kidney Disease, CKD）是全球公共衛(wèi)生問題，并呈進(jìn)展性、不可逆轉(zhuǎn)性發(fā)展為終末期腎衰竭（End Stage Renal Dysfunction, ESRD）。ESRD的最終歸途為腎纖維化，其顯著的病理特征表現(xiàn)為腎小球硬化、腎小管萎縮和腎小管間質(zhì)膠原纖維沉積。足細(xì)胞（Podocyte），即腎小囊臟層上皮細(xì)胞損傷誘導(dǎo)蛋白尿的產(chǎn)生被認(rèn)為是腎小球硬化的核心事件。但是足細(xì)胞損傷的相關(guān)調(diào)控機(jī)制尚不明確。研究表明，足細(xì)胞可作為一種非專職的抗原呈遞細(xì)胞介導(dǎo)腎小球腎炎的發(fā)生。體內(nèi)外實驗研究表明，病理狀態(tài)下足細(xì)胞膜表面MHC II類分子表達(dá)上調(diào)，且共刺激信號分子B7-1的表達(dá)水平也出現(xiàn)了顯著增加。

2013年，新英格蘭雜志首次報道B7-1的靶向抑制劑CTLA4-免疫球蛋白融合蛋白（CTLA4-Ig）阿巴西普可以治療原發(fā)和復(fù)發(fā)性局灶節(jié)段性腎小球硬化（FSGS）以及微小病變（MCD）患者^[2]。但圍繞著足細(xì)胞特異性表達(dá)B7-1的檢測及CTLA4-Ig在腎臟病臨床應(yīng)用爭議不休^[3]。因此，明確足細(xì)胞B7-1的特異性表達(dá)及作用機(jī)制具有十分重要的意義。

2022年6月，南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院腎內(nèi)科周麗麗教授團(tuán)隊在Cell Death & Differentiation發(fā)表了題為“B7-1 mediates podocyte injury and glomerulosclerosis through communication with Hsp90ab1-LRP5-β-catenin pathway”的最新研究成果。該研究充分證明了腎小球病理狀態(tài)下，足細(xì)胞共刺激信號分子B7-1表達(dá)上調(diào)，并發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞B7-1通過Hsp90ab1激活β-catenin信號誘導(dǎo)蛋白尿和腎小損傷的作用機(jī)制^[1]。
 

圖片來源：Cell Death & Differentiation

研究材料與方法
在該研究中，研究人員通過RNAscope和免疫熒光共定位等實驗充分證明足細(xì)胞損傷誘導(dǎo)B7-1表達(dá)上調(diào)。為研究足細(xì)胞B7-1的致病機(jī)制，他們使用了多個小鼠模型，并委托賽業(yè)生物構(gòu)建了足細(xì)胞特異性表達(dá)B7-1轉(zhuǎn)基因小鼠（Tg小鼠）。通過轉(zhuǎn)錄組測序、IP-MS分析、分子對接模擬、分離腎小球微器官培養(yǎng)、腺相關(guān)病毒構(gòu)建基因敲除小鼠等技術(shù)手段，發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞B7-1與Hsp90ab1相互作用介導(dǎo)β-catenin信號活化，導(dǎo)致足細(xì)胞損傷和腎小球硬化的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)機(jī)制。

技術(shù)路線
01 腎病患者組織和動物模型中檢測腎小球足細(xì)胞B7-1表達(dá)水平和足細(xì)胞損傷的相關(guān)性。
02 構(gòu)建足細(xì)胞特異性過表達(dá)B7-1轉(zhuǎn)基因小鼠，轉(zhuǎn)錄組測序和實驗分析驗證足細(xì)胞B7-1上調(diào)表達(dá)誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷及其作用機(jī)制。
03 通過體內(nèi)外阿霉素誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷模型及B7-1表達(dá)干擾實驗，驗證下調(diào)B7-1可緩解蛋白尿發(fā)生和足細(xì)胞損傷。
04 通過IP-MS實驗及分子對接模擬分析發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞B7-1與Hsp90ab1的相互作用，并通過LRP5介學(xué)β-catenin活化。
05 通過腺相關(guān)病毒AAV原位注射干擾Tg小鼠Hsp90ab1表達(dá)，并通過抑制劑或質(zhì)粒注射干擾阿霉素動物模型，明確B7-1通過Hsp90ab1激活β-catenin信號并介導(dǎo)足細(xì)胞損傷的效應(yīng)。
06 細(xì)胞實驗及染色質(zhì)免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)β-catenin活化入核促進(jìn)足細(xì)胞B7-1的表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)。

研究結(jié)果
1.足細(xì)胞B7-1在多種腎小球疾病中上調(diào)并伴有β-catenin信號激活
既往研究中發(fā)現(xiàn)腎病患者切片腎小球B7-1蛋白檢測存在重復(fù)性差的缺點，為此，研究人員通過RNAscope原位雜交技術(shù)檢測腎小球B7-1的mRNA水平，并通過足細(xì)胞標(biāo)志物α-actinin4免疫熒光共定位明確B7-1表達(dá)上調(diào)定位于足細(xì)胞。ELISA實驗檢測新入院腎病患者尿液中可溶性B7-1的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)B7-1與腎小球濾過率呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，而與尿白蛋白水平呈正相關(guān)關(guān)系，提示B7-1與足細(xì)胞及腎小球損傷密切相關(guān)。同時研究人員還對多個腎小球疾病動物模型進(jìn)行檢測，結(jié)果均提示足細(xì)胞B7-1表達(dá)上調(diào)，且腎損傷關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白β-catenin信號增強(qiáng)。
 

圖1 足細(xì)胞B7-1在多種腎小球病理條件下表達(dá)上調(diào)^[1]

2.B7-1通過激活β-catenin信號通路介導(dǎo)足細(xì)胞損傷
為了探究足細(xì)胞B7-1如何介導(dǎo)蛋白尿（Proteinuria）的發(fā)生及足細(xì)胞損傷，研究人員委托賽業(yè)公司構(gòu)建了足細(xì)胞特異表達(dá)B7-1轉(zhuǎn)基因小鼠（Tg小鼠）。對自然狀態(tài)下多個時間點的Tg小鼠進(jìn)行取材及研究發(fā)現(xiàn)，隨著時間推移，足細(xì)胞B7-1表達(dá)上調(diào)，并伴隨尿蛋白水平增加、腎小球結(jié)構(gòu)改變及足細(xì)胞上皮標(biāo)志物的丟失。通過轉(zhuǎn)錄組測序及相關(guān)驗證發(fā)現(xiàn)Tg小鼠腎臟組織β-catenin信號活化。相反，將B7-1基因表達(dá)敲低可以抑制β-連環(huán)蛋白從而減輕足細(xì)胞損傷和腎小球損傷。
 

圖2 足細(xì)胞B7-1上調(diào)促進(jìn)蛋白尿和足細(xì)胞損傷進(jìn)展^[1]

3.Hsp90ab1在B7-1向LRP5/β-catenin通路的信號傳遞中起關(guān)鍵作用
為了進(jìn)一步探究足細(xì)胞B7-1如何通過β-catenin信號通路介導(dǎo)足細(xì)胞損傷，研究人員采用足細(xì)胞過表達(dá)B7-1并進(jìn)行IP-MS技術(shù)鑒定分析，并通過體內(nèi)外蛋白質(zhì)免疫共沉淀及免疫熒光共定位等手段進(jìn)行驗證，發(fā)現(xiàn)B7-1可能通過Hsp90ab1介導(dǎo)β-catenin信號通路。
 

圖3 IP-MS及體內(nèi)外實驗驗證足細(xì)胞B7-1與Hsp90ab1相互作用^[1]

B7-1與Hsp90ab1究竟是如何相互作用，并介導(dǎo)β-catenin活化的呢，研究人員通過分子對接模擬和蛋白定點突變等方法進(jìn)行驗證，發(fā)現(xiàn)位于Hsp90ab1N端的K69位點可能是B7-1的有效結(jié)合位點，介導(dǎo)了B7-1的下游效應(yīng)。同時，通過文獻(xiàn)查閱發(fā)現(xiàn)，Hsp90ab1可能通過結(jié)合LRP5激活β-catenin,為此研究人員進(jìn)一步模擬出了三者的結(jié)合構(gòu)象，并對其進(jìn)行了相關(guān)驗證，結(jié)果顯示B7-1-Hsp90ab1-LRP5復(fù)合體形成可能是介導(dǎo)β-catenin信號通路的重要橋梁。

圖4 分子對接模擬確定B7-1與Hsp90ab1的結(jié)合位點，B7-1通過Hsp90ab1及LRP5傳遞信號激活β-catenin信號^[1]

4.Hsp90ab1介導(dǎo)B7-1誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷和腎小球損傷

為了進(jìn)一步明確Hsp90ab1的作用，研究人員通過AAV原位注射實驗干擾Tg小鼠腎臟Hsp90ab1表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲低Hsp90ab1表達(dá)可以抑制β-catenin活化，減輕由B7-1誘導(dǎo)的蛋白尿和足細(xì)胞損傷。
 

圖5 敲低Hsp90ab1可通過抑制β-catenin信號減輕足細(xì)胞B7-1上調(diào)誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷^[1]

β-catenin信號活化是否對B7-1也有作用呢，研究人員通過染色質(zhì)免疫共沉淀的方法進(jìn)行驗證，發(fā)現(xiàn)，活化的β-catenin轉(zhuǎn)位入核介導(dǎo)B7-1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，從而構(gòu)成正反饋調(diào)節(jié)環(huán)。

圖6 β-catenin介導(dǎo)B7-1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控^[1]
 

研究結(jié)論

圖7 足細(xì)胞B7-1介導(dǎo)β-catenin信號活化誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷的潛在機(jī)制^[1]

綜上所述，該研究綜合了RNAscope、Tg小鼠、轉(zhuǎn)錄組測序、蛋白質(zhì)譜測序、分子對接模擬及AAV原位注射等技術(shù)手段，充分說明了腎小球損傷誘導(dǎo)足細(xì)胞B7-1表達(dá)上調(diào)，繼而通過B7-1與Hsp90ab1的相互作用介導(dǎo)B7-1-Hsp90ab1-LRP5復(fù)合體的形成，促進(jìn)β-catenin活化發(fā)生酪氨酸磷酸化進(jìn)一步轉(zhuǎn)位入核繼而引起下游級聯(lián)反應(yīng)。此外，β-catenin入核可以繼續(xù)調(diào)控B7-1的基因轉(zhuǎn)錄水平，B7-1與β-catenin通路形成正反饋調(diào)節(jié)環(huán)路從而促進(jìn)足細(xì)胞損傷和腎小球硬化的持續(xù)進(jìn)展。

參考文獻(xiàn)：

[1] Li, J., et al., B7-1 mediates podocyte injury and glomerulosclerosis through communication with Hsp90ab1-LRP5-beta-catenin pathway. Cell Death Differ, 2022.

[2] Yu, C.C., et al., Abatacept in B7-1-positive proteinuric kidney disease. N Engl J Med, 2013. 369(25): p. 2416-23.

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品系名稱：
C57BL/6J-Cd80^em1(flox)Cya

品系編號：
CKOCMP-12519-Cd80-B6J-VB

產(chǎn)品編號：
S-CKO-17617

應(yīng)用方向：
免疫系統(tǒng),細(xì)胞增殖細(xì)胞組成,造血系統(tǒng),細(xì)胞生物學(xué),代謝研究,生理系統(tǒng),分子生物學(xué)

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