乙酰化修飾和代謝組揭示內(nèi)皮細(xì)胞衰老新機(jī)制

血管老化不僅是人體衰老的始發(fā)關(guān)鍵因素，而且還是動脈粥樣硬化等血管性疾病的共同病理基礎(chǔ)。當(dāng)長期暴露于心血管疾病危險因素中，血管內(nèi)皮細(xì)胞呈現(xiàn)早熟性應(yīng)激性衰老表型。近年來，內(nèi)皮細(xì)胞的物質(zhì)代謝，尤其是脂肪酸代謝，其病理生理意義越來越受到重視，但是內(nèi)皮細(xì)胞脂肪酸代謝與內(nèi)皮細(xì)胞衰老之間的關(guān)系尚不清楚。

2022年8月，中山大學(xué)李卓明教授研究團(tuán)隊在Oxidative Medicine and Cellular Longevity（IF 7.31）期刊上發(fā)表了題為“Disturbance of Fatty Acid Metabolism Promoted Vascular Endothelial Cell Senescence via Acetyl-CoA-Induced Protein Acetylation Modification”的文章，該文章利用乙酰化修飾組學(xué)和代謝組學(xué)等方法揭示了衰老內(nèi)皮細(xì)胞中脂肪酸代謝的變化以及脂肪酸代謝在內(nèi)皮衰老中的潛在調(diào)節(jié)機(jī)制，即脂肪酸代謝紊亂通過蛋白質(zhì)乙�；�修飾促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的衰老。該研究為血管衰老及相關(guān)心血管疾病提供了靶向內(nèi)皮細(xì)胞代謝的治療策略。中科新生命為該研究提供了乙�；�修飾蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)技術(shù)服務(wù)。

 研究材料

H₂O₂誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞衰老模型、細(xì)胞傳導(dǎo)培養(yǎng)誘導(dǎo)的復(fù)制性內(nèi)皮細(xì)胞衰老模型、自發(fā)性高血壓大鼠和Ang II輸注小鼠內(nèi)皮衰老動物模型

 

 技術(shù)路線

步驟1：內(nèi)皮細(xì)胞衰老伴有脂肪酸代謝抑制；

步驟2：衰老內(nèi)皮細(xì)胞中脂肪酸代謝相關(guān)酶的表達(dá)水平降低；

步驟3：CPT1A依賴的LCFA代謝可阻抑內(nèi)皮細(xì)胞衰老；

步驟4：補充短鏈脂肪酸在體外和體內(nèi)均對內(nèi)皮細(xì)胞的衰老有挽救作用；

步驟5：脂肪酸代謝通過乙酰輔酶A調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞衰老；

步驟6：衰老內(nèi)皮細(xì)胞中乙酰化蛋白譜發(fā)生改變。

 

 研究結(jié)果

1. 內(nèi)皮細(xì)胞衰老伴有脂肪酸代謝抑制

在本研究中，通過檢測H₂O₂誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞衰老和細(xì)胞傳導(dǎo)培養(yǎng)誘導(dǎo)的復(fù)制性內(nèi)皮細(xì)胞衰老中棕櫚酸基耗氧率(OCR)，研究脂肪酸代謝。結(jié)果表明，在內(nèi)皮細(xì)胞衰老過程中，脂肪酸代謝下降（圖1a-1d）。此外，通過代謝組學(xué)發(fā)現(xiàn)，在衰老內(nèi)皮細(xì)胞中大部分中、長鏈脂肪酸、飽和及不飽和脂肪酸、亞油酸甲酯和二十二碳六烯酸(DHA)、TCA周期相關(guān)有機(jī)酸代謝產(chǎn)物、FAO（脂肪酸氧化）的代謝產(chǎn)物乙酰輔酶A在衰老內(nèi)皮細(xì)胞中均有所下降，NAD/NADH升高(圖1e和1f)。綜上所述，脂肪酸代謝紊亂與內(nèi)皮細(xì)胞衰老有關(guān)。

 

圖1 內(nèi)皮細(xì)胞衰老伴有脂肪酸代謝抑制

 

2. 衰老內(nèi)皮細(xì)胞中脂肪酸代謝相關(guān)酶的表達(dá)水平降低

為了探索脂肪酸代謝異常的可能機(jī)制，作者研究了衰老內(nèi)皮細(xì)胞中脂肪酸攝取、轉(zhuǎn)運和β-氧化相關(guān)蛋白的mRNA表達(dá)。結(jié)果表明與脂肪酸攝取相關(guān)的脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白(FATP) 6、與轉(zhuǎn)運相關(guān)的肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1 (CPT1)、肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶2 (CPT2)均明顯減少。這些結(jié)果表明，與脂肪酸攝取和線粒體進(jìn)入相關(guān)的蛋白的下調(diào)抑制了內(nèi)皮細(xì)胞衰老過程中的脂肪酸代謝。作者進(jìn)一步深入研究了CPT1A（內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)的CPT1亞型）蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明在細(xì)胞水平（體外）和內(nèi)皮衰老動物模型（體內(nèi)）中，CPT1A的表達(dá)均明顯減少，即表明CPT1A在內(nèi)皮細(xì)胞衰老過程中受到抑制（圖2）。

圖2 衰老內(nèi)皮細(xì)胞中脂肪酸代謝相關(guān)酶CPT1A的表達(dá)水平顯著下調(diào)

 

3.  CPT1A依賴的LCFA代謝可防止內(nèi)皮細(xì)胞衰老

CPT1A被認(rèn)為是內(nèi)皮細(xì)胞中LCFA(長鏈脂肪酸)氧化的限速酶，因此衰老內(nèi)皮細(xì)胞中CPT1A的下降可能通過抑制CPT1A依賴的LCFA從而導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞衰老。為了驗證這一假設(shè)，作者采用CPT1A siRNA、CPT1A抑制劑依托莫昔(ETO)和過表達(dá)CPT1A的方式研究內(nèi)皮細(xì)胞衰老的機(jī)制。結(jié)果表明CPT1A的抑制（siRNA、ETO處理）增加了衰老細(xì)胞的比例、上調(diào)細(xì)胞周期因子的表達(dá)、降低增殖細(xì)胞的比例（圖3a-3c），過表達(dá)CPT1A則逆轉(zhuǎn)了上述現(xiàn)象（圖3d-3f）。綜上所述，CPT1A依賴的LCFA代謝可以防止內(nèi)皮細(xì)胞衰老，抑制CPT1A可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞衰老。
 

圖3 CPT1A依賴的LCFA代謝可防止內(nèi)皮細(xì)胞衰老

 

4. 補充短鏈脂肪酸在體外和體內(nèi)均對內(nèi)皮細(xì)胞的衰老有挽救作用

與LCFAs不同，SCFAs（斷鏈脂肪酸）不依賴于CPT1進(jìn)入線粒體，為線粒體氧化途徑補充脂酰。因此，在本研究中加入乙酸或丙酸（短鏈脂肪酸）研究CPT1A非依賴的SCFAs是否能夠改善內(nèi)皮細(xì)胞衰老。體外結(jié)果表明乙酸和醋酸均具有明顯的抗衰老作用（圖4a-c、圖5），醋酸在體內(nèi)實驗中也顯著改善了內(nèi)皮層的衰老（圖4d-4g）。

圖4 補充短鏈脂肪酸在體內(nèi)外均對內(nèi)皮細(xì)胞的衰老有挽救作用

圖5 補充短鏈脂肪酸對CPT1A受抑引起的內(nèi)皮細(xì)胞衰老有挽救作用

 

5. 脂肪酸代謝通過乙酰輔酶A調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞衰老

由于乙酰輔酶A是脂肪酸代謝的最終產(chǎn)物，因此內(nèi)皮衰老過程中CPT1A依賴的LCFA氧化的減少可導(dǎo)致乙酰輔酶A水平改變（圖6a和6b）。由此推測乙酰輔酶A在內(nèi)皮細(xì)胞衰老中的發(fā)揮重要作用，因此作者使用了乙酰輔酶A的抑制劑-ATP檸檬酸裂解酶(ACLY)抑制進(jìn)行驗證。結(jié)果表明乙酰輔酶A水平的降低可加劇內(nèi)皮細(xì)胞的衰老（圖6c-6f），乙酸和醋酸則逆轉(zhuǎn)內(nèi)皮細(xì)胞衰老（圖6d-6f）。
 

圖6 脂肪酸代謝通過乙酰輔酶A調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞衰老

 

6. 衰老內(nèi)皮細(xì)胞中乙酰化蛋白譜發(fā)生改變

由于乙酰輔酶A參與了內(nèi)皮細(xì)胞衰老的調(diào)控，而乙酰輔酶A是賴氨酸乙酰化的主要乙�；�供體，由此推測乙酰輔酶A可能影響內(nèi)皮細(xì)胞衰老過程中蛋白質(zhì)乙酰化修飾。為了驗證這一假設(shè)，作者開展了乙�；�修飾組學(xué)。此次共鑒定到2706個乙�；�蛋白，其中有43個乙�；�賴氨酸位點的40個蛋白質(zhì)在衰老細(xì)胞中乙酰化水平顯著降低（圖7b-7d）, KEGG通路分析顯示這些蛋白與細(xì)胞能量代謝、細(xì)胞周期密切相關(guān)（圖7e）。綜上所述，CPT1A依賴的脂肪酸代謝缺陷導(dǎo)致乙酰輔酶A缺失，導(dǎo)致蛋白質(zhì)乙酰化被抑制，進(jìn)而加劇細(xì)胞代謝，抑制細(xì)胞周期，最終導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞衰老。

圖7 衰老內(nèi)皮細(xì)胞中乙�；�蛋白譜發(fā)生改變

 

小編小結(jié)

本項研究中，作者采用代謝組學(xué)、乙�；�修飾組學(xué)等方式揭示了內(nèi)皮細(xì)胞代謝與內(nèi)皮細(xì)胞衰老之間的關(guān)系。即在衰老的內(nèi)皮細(xì)胞中脂肪酸氧化(FAO)被抑制，脂肪酸譜被擾亂，CPT1A蛋白的表達(dá)顯著降低。在機(jī)制上，脂肪酸代謝通過乙酰輔酶A調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的衰老。此外，通過補充短鏈脂肪酸或乙酰輔酶A可以防止內(nèi)皮細(xì)胞的衰老。這些發(fā)現(xiàn)提示改善脂肪酸代謝可能改善內(nèi)皮細(xì)胞衰老相關(guān)的心血管疾病。