Rictor在剪切應(yīng)力下保持內(nèi)皮的完整性

哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）參與各種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)，并且與心血管疾�。–VDs）的發(fā)展密切相關(guān)。mTOR是PI3K相關(guān)激酶家族中的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可以形成兩種不同的多蛋白復(fù)合物，mTORC1和mTORC2來行使不同的功能。mTORC2參與細(xì)胞存活，細(xì)胞骨架重塑和細(xì)胞遷移的調(diào)節(jié)。Rictor是mTORC2的核心成分，在調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞中發(fā)揮重要作用。此外，具有內(nèi)皮Rictor敲除的小鼠表現(xiàn)出胚胎致死性，并且有條件地敲除內(nèi)皮Rictor顯著降低了成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的小鼠新生血管形成。然而，關(guān)于Rictor對(duì)內(nèi)皮結(jié)構(gòu)或功能的影響的研究通常缺乏。

內(nèi)皮完整性喪失或內(nèi)皮功能障礙被認(rèn)為是心血管疾病的誘發(fā)因素，例如高血壓。血管內(nèi)皮的結(jié)構(gòu)完整性取決于內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）之間的細(xì)胞連接。粘附連接（AJs）是細(xì)胞連接的主要類型。血管內(nèi)皮鈣粘蛋白（VE-cadherin）是AJs的主要蛋白質(zhì)成分。

在血管的分支和分叉處，ECs受到振蕩剪切應(yīng)力或低剪切應(yīng)力（LSS）的刺激。在這里，內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)不平衡，容易發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化。相反，在直血管區(qū)域，觀察到單向血流，生理剪切應(yīng)力（PSS）對(duì)血管內(nèi)皮具有保護(hù)作用。然而，在剪切應(yīng)力條件下，Rictor在內(nèi)皮完整性和血管內(nèi)皮鈣粘蛋白表達(dá)中的作用缺乏研究。

血管性血友病因子（VWF）是內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)的另一個(gè)關(guān)鍵標(biāo)志物。mTOR激酶抑制劑可以在不影響細(xì)胞內(nèi)VWF分泌的情況下抑制血栓形成。然而，尚未報(bào)道VWF和Rictor在內(nèi)皮損傷中的關(guān)系。

在南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科、南京醫(yī)科大學(xué)附屬江寧醫(yī)院重癥科的一項(xiàng)研究中，驗(yàn)證了Rictor在生理穩(wěn)態(tài)下對(duì)內(nèi)皮完整性的影響，以及LSS誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮損傷下對(duì)VE-鈣粘蛋白和VWF表達(dá)的影響。
 

Rictor 缺失破壞了層流區(qū)域的內(nèi)皮完整性

在成功生成內(nèi)皮Rictor缺失小鼠模型后，實(shí)驗(yàn)選擇了Rictor^fl/fl 和 Rictor^iΔEC  小鼠胸主動(dòng)脈檢測(cè)內(nèi)皮形態(tài)，其中內(nèi)皮細(xì)胞暴露于PSS（15 dyn/cm2）。結(jié)果顯示，Rictor缺失后內(nèi)皮完整性受損（圖1）。以上結(jié)果表明，內(nèi)皮Rictor缺失可導(dǎo)致內(nèi)皮完整性喪失。
 

圖1   Rictor 缺失破壞了胸主動(dòng)脈區(qū)域的內(nèi)皮完整性。

圖像顯示Rictor^fl/fl （上）和 Rictor^iΔEC  （下）小鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮的形態(tài)。從左到右的紅色框區(qū)域是局部放大區(qū)域，黑色箭頭表示流向。

 

Rictor 缺失破壞了左頸總動(dòng)脈區(qū)域的內(nèi)皮完整性并擴(kuò)大了細(xì)胞連接

為了在體內(nèi)病理狀態(tài)下模擬LSS（2 dyn/cm2），在小鼠中部分結(jié)扎左頸總動(dòng)脈（LCA），右頸總動(dòng)脈（RCA）未結(jié)扎。結(jié)果顯示，LCA血管內(nèi)皮受損，Rictor^iΔEC 小鼠表現(xiàn)出更明顯的內(nèi)皮形態(tài)損傷。此外，LSS刺激使細(xì)胞連接變寬，Rictor^iΔEC 小鼠的LCA細(xì)胞連接間隙更明顯。以上結(jié)果表明，Rictor的缺失參與了LSS引起的血管內(nèi)皮損傷的病理過程。

 

Rictor 缺失促進(jìn)應(yīng)力纖維形成

接下來探討了Rictor缺失加重LSS誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮形態(tài)損傷的機(jī)制。F-肌動(dòng)蛋白是內(nèi)皮細(xì)胞連接復(fù)合物的重要組成部分。F-肌動(dòng)蛋白以完整和連續(xù)的形式位于細(xì)胞膜的外圍，并與 VE-鈣粘蛋白復(fù)合物結(jié)合形成線性 AJs 以維持內(nèi)皮屏障功能。

實(shí)驗(yàn)在體外模擬了平行板流動(dòng)室系統(tǒng)中不同類型剪切應(yīng)力對(duì)HUVECs的刺激。結(jié)果顯示，在PSS條件下，F(xiàn)-肌動(dòng)蛋白主要均勻分布在細(xì)胞周圍。用LSS刺激HUVECs 1h后，F(xiàn)-肌動(dòng)蛋白的極性受到干擾。觀察到明顯的應(yīng)力纖維形成。在LSS條件下沉默Rictor后觀察到增強(qiáng)的應(yīng)力纖維形成（圖2 A、B）。這一發(fā)現(xiàn)表明，Rictor對(duì)細(xì)胞骨架蛋白的排列很重要，表明Rictor可能通過調(diào)節(jié)F-肌動(dòng)蛋白的分布和排列參與LSS誘導(dǎo)的ECs的形態(tài)變化。

圖2   Rictor參與了剪切應(yīng)力下細(xì)胞骨架的排列。

（A）免疫熒光圖像顯示了由LSS刺激和有或沒有Rictor siRNA轉(zhuǎn)染的肌動(dòng)蛋白絲（F-肌動(dòng)蛋白）的極性。（B）測(cè)量F-肌動(dòng)蛋白的平均熒光強(qiáng)度。

 

低剪切應(yīng)力引起的粘附連接斷裂

內(nèi)皮 AJs 在維持內(nèi)皮完整性方面起著關(guān)鍵作用。在體外，觀察到AJs的主要蛋白VE-鈣粘蛋白的表達(dá)和定位。在PSS刺激下，VE-鈣粘蛋白主要位于細(xì)胞膜上，細(xì)胞連接處染色清晰光滑。然而，在LSS刺激下，VE-鈣粘蛋白部分轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞連接處的鋸齒狀減小。此外，細(xì)胞間隙明顯形成（圖3 A）。通過免疫印跡檢測(cè)HUVECs中的VE-鈣粘蛋白表達(dá)。LSS導(dǎo)致VE-鈣粘蛋白膜蛋白表達(dá)降低（圖3 C），而總蛋白表達(dá)不變（圖3 B）。上述結(jié)果表明，在LSS暴露期間，VE-鈣粘蛋白在AJs的穩(wěn)定性降低，隨后VE-鈣粘蛋白易位。
 

圖3   LSS促進(jìn)了VE-鈣粘蛋白的易位。

（A）免疫熒光顯示VE-鈣粘蛋白在不同類型剪切應(yīng)力下的定位。VE-鈣粘蛋白在LSS刺激后在膜上的定位較少。右圖顯示了細(xì)胞間隙的定量。（B）在不同類型的剪切應(yīng)力下檢測(cè)總VE-鈣粘蛋白表達(dá)。（C）在不同類型的剪切應(yīng)力下檢測(cè)細(xì)胞膜上VE-鈣粘蛋白的表達(dá)。

 

下調(diào)Rictor降低低剪切應(yīng)力刺激下血管內(nèi)皮-鈣粘蛋白表達(dá)及其膜定位

接下來，Rictor是否通過VE-鈣粘蛋白影響ECs的完整性。在體外驗(yàn)證Rictor siRNA的轉(zhuǎn)染效率。用Rictor siRNA轉(zhuǎn)染HUVECs，然后用PSS或LSS刺激1小時(shí)。免疫印跡顯示，在LSS刺激下，下調(diào)Rictor抑制VE-鈣粘蛋白表達(dá)。在體內(nèi)，Rictor^iΔEC小鼠的LCA中總VE-鈣粘蛋白和VE-鈣粘蛋白在細(xì)胞膜上的定位降低。以上結(jié)果表明，Rictor缺失加劇了LSS刺激的HUVECs中VE-鈣粘蛋白的內(nèi)化和重塑以及F-肌動(dòng)蛋白，這是導(dǎo)致內(nèi)皮形態(tài)損傷的重要機(jī)制。

 

低剪切應(yīng)力促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞中血管性血友病因子的表達(dá)

VWF是另一種調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵蛋白，其表達(dá)在不同剪切應(yīng)力刺激下發(fā)生變化。在體內(nèi)，與Rictor^fl/fl 小鼠的RCA相比，VWF在LCA中上調(diào)。在體外，LSS刺激后VWF顯著上調(diào)。上述數(shù)據(jù)表明，LSS上調(diào)了VWF表達(dá)。

 

下調(diào)Rictor抑制低剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的血管性血友病因子表達(dá)

接下來探討了Rictor在LSS誘導(dǎo)的VWF表達(dá)中的作用。結(jié)果顯示，下調(diào)Rictor抑制LSS誘導(dǎo)的VWF表達(dá)。在體外，siRNA用于沉默Rictor，免疫印跡顯示下調(diào)Rictor抑制LSS誘導(dǎo)的VWF蛋白表達(dá)。結(jié)果表明，Rictor介導(dǎo)了LSS誘導(dǎo)的VWF表達(dá)。

 

血管內(nèi)皮鈣粘蛋白下調(diào)降低了低剪切應(yīng)力促進(jìn)的血管性血友病因子表達(dá)

為了探索VE-鈣粘蛋白對(duì)LSS刺激下VWF表達(dá)的影響，實(shí)驗(yàn)首先使用了免疫印跡（圖4 A）和 PCR （圖4 B）檢測(cè)以驗(yàn)證CDH5（VE-鈣粘蛋白的基因名稱）的三個(gè)siRNA序列，并選擇具有最佳敲低效果的序列進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。免疫印跡和IF檢測(cè)顯示，LSS刺激誘導(dǎo)的VWF表達(dá)上調(diào)依賴于VE-鈣粘蛋白（圖4 C、D）。這些結(jié)果表明，LSS至少部分通過VE-鈣粘蛋白調(diào)節(jié)VWF，并表明Rictor/VE-鈣粘蛋白/VWF通路介導(dǎo)LSS誘導(dǎo)的內(nèi)皮完整性破壞。

圖4    VE-鈣粘蛋白的下調(diào)降低了VWF表達(dá)。

（A）代表性圖像顯示VE-鈣粘蛋白（CDH5）的敲低。C和NC分別代表對(duì)照組和陰性對(duì)照組。（B）PCR檢測(cè)CDH5敲低效率。（C）VWF蛋白的表達(dá)是在不同類型的剪切應(yīng)力和有或沒有siCDH5 siRNA轉(zhuǎn)染下通過免疫印跡檢測(cè)的。（D）免疫熒光圖像顯示VE-鈣粘蛋白下調(diào)降低了VWF表達(dá)。

 

總之，該研究首次報(bào)道了Rictor在LSS下通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮AJs和VWF在維持血管內(nèi)皮完整性和介導(dǎo)內(nèi)皮損傷方面發(fā)揮作用。此外，Rictor同時(shí)影響PSS和LSS下的AJs和VWF蛋白，表明它可能是一種機(jī)械傳感器，它的存在在機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起著重要作用。

 

參考文獻(xiàn)：Li H, Zhou WY, Liu YX, Xia YY, Xia CL, Pan DR, Li Z, Shi Y, Chen SL, Zhang JX. Rictor maintains endothelial integrity under shear stress. Front Cell Dev Biol. 2022 Nov 10;10:963866. doi: 10.3389/fcell.2022.963866. PMID: 36438564; PMCID: PMC9685313.

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36438564/

 

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