高通量單B細胞篩選技術(shù)及解決方案

抗體（antibody）是指機體因抗原刺激而產(chǎn)生的具有保護作用的蛋白質(zhì)。其中利用分子生物學(xué)技術(shù)生產(chǎn)，用于疾病或病毒感染治療的抗體，被稱為抗體藥物�？贵w藥物，具有直擊腫瘤特異性抗原、高特異性、低不良反應(yīng)和療效確切等特點，在腫瘤、自身免疫、代謝、病毒感染等疾病領(lǐng)域顯示出獨特的優(yōu)勢和廣闊的應(yīng)用前景，是目前最大的治療用生物劑類別。
 
單克隆抗體作為抗體藥物的先行者，在全世界十大用藥里面有 7 個是單抗藥，已經(jīng)在多個治療領(lǐng)域展現(xiàn)出其獨特的治療價值�？贵w藥物在研發(fā)周期上跟小分子藥物相比也有所縮短，市場需求亦逐年擴容，逐漸成為生物醫(yī)藥領(lǐng)域的重要發(fā)展方向。并且隨著現(xiàn)代生物技術(shù)發(fā)展及對抗體結(jié)構(gòu)和功能不斷深入認識，研究人員通過不同抗體片段的組合、對抗體表面的位點進行修飾、偶聯(lián)小分子藥物或其他化學(xué)物質(zhì)等策略，發(fā)展了數(shù)量龐大的抗體結(jié)構(gòu)形式，并各有優(yōu)勢。包括抗體融合蛋白 、抗體偶聯(lián)藥物（ADC）、雙特異性抗體（BsAb）、小分子抗體片段等。從目前的研發(fā)流程來看，這些其他類別的抗體藥物也是從單克隆抗體發(fā)現(xiàn)開始。另外在細胞治療領(lǐng)域，細胞治療相關(guān)的 CAR-T 和 CAR-NK 的 CAR 候選分子開發(fā)需要對單克隆抗體與抗原結(jié)合的親和力進行篩選，研發(fā)起點同樣始于單克隆抗體發(fā)現(xiàn)。以上生物治療相關(guān)的產(chǎn)品開發(fā)，從研發(fā)流程來看，都起始于單克隆抗體發(fā)現(xiàn)�？梢妴慰寺】贵w市場需求容量龐大，因此單克隆抗體篩選技術(shù)的迭代亦備受矚目，發(fā)展也是日新月異。
 
單克隆抗體發(fā)現(xiàn)
目前，單克隆抗體發(fā)現(xiàn)的技術(shù)主要有雜交瘤技術(shù)、噬菌體展示技術(shù)和單 B 細胞篩選技術(shù)。其中單 B 細胞篩選技術(shù)因為其研發(fā)周期短而備受矚目。 雜交瘤技術(shù)：可篩選出無限增殖并分泌抗體的雜交融合細胞，用于穩(wěn)定生產(chǎn)具有天然活性的單克隆抗體。但通常制備需 5-6 個月，且得到的抗體免疫原性高、半衰期短、批間差異大，其次融合效率低，易丟失抗體的多樣性，不利于新抗體的發(fā)現(xiàn)。  
噬菌體展示技術(shù)：將抗體 DNA 序列插入噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因適當位置，抗體隨噬菌體組裝展示于噬菌體表面。該技術(shù)無需 B 細胞培養(yǎng)過程，但是抗體未經(jīng)過體內(nèi)成熟過程，抗體序列往往親和力有限，特異性差，重鏈和輕鏈的隨機組合，使得抗體重鏈輕鏈無法保持天然配對。  
單 B 細胞篩選技術(shù)：是近年來新興的單抗發(fā)現(xiàn)技術(shù)，其將單細胞分離鑒定技術(shù)與分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合，獲得單個 B 細胞抗體基因并進行體外克隆和表達，獲得的抗體保證了輕重鏈可變區(qū)的天然配對，相較于傳統(tǒng)的抗體制備技術(shù)，具有效率高、全人源、基因多樣性豐富、細胞數(shù)量少、周期短、適用于任意動物抗體篩選等優(yōu)點。因可直接獲得抗體基因序列，方便下游抗體工程改造，在抗體藥物研發(fā)、快速應(yīng)對病原微生物傳染病方面具有巨大優(yōu)勢，是免疫診斷試劑和治療藥物開發(fā)的理想選擇。

 單克隆抗體發(fā)現(xiàn)技術(shù)方法總結(jié)對比 

 
單 B 細胞篩選技術(shù)
基于單 B 細胞篩選技術(shù)有諸多優(yōu)勢但存在抗原特異性細胞比例低的特點，需要借助高通量及高靈敏的分選系統(tǒng)對少量的特異性 B 細胞進行富集，目前用于單 B 細胞抗體篩選技術(shù)主要有液滴微流控技術(shù)、微孔/微腔室技術(shù)和流式細胞分選技術(shù)。 液滴微流控是近年來微流控領(lǐng)域的一個重要發(fā)展分支，該技術(shù)將每一個微液滴視為一個獨立的反應(yīng)器，以實現(xiàn)大規(guī)模的反應(yīng)檢測與篩選�；�于液滴微流控的分選技術(shù)，具有通量高、成本低、操作簡單等優(yōu)勢，在單 B 抗體發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域具有巨大潛力。而目前，成熟商業(yè)化的儀器平臺仍然較少，存在較大的未被滿足的需求。
基于微孔/微腔室技術(shù)的單 B 細胞分選，其先將細胞導(dǎo)入微孔小室，之后再導(dǎo)入檢測試劑，基于熒光信號分選陽性細胞，可通過抗原特異性檢測，分選出分泌型功能漿 B 細胞，單張芯片可實現(xiàn) 1-2w 個細胞評估分選，解決了單細胞分離和單細胞篩選問題，但篩選通量有限，且商業(yè)化的儀器成本和單次運行成本都非常昂貴，引入門檻過高，整體市場占有率較低。 
而流式細胞技術(shù)，基于細胞表面或胞內(nèi)標志物對細胞進行分選，無法基于細胞分泌的蛋白進行分選，因此只適合于記憶型 B 細胞的分選，無法直接對分泌抗體的漿細胞進行功能性檢測，存在后期工作量大、成本高、靈敏度低、假陽性率高等局限性。
液滴微流控是近年來微流控領(lǐng)域的一個重要發(fā)展分支，該技術(shù)將每一個微液滴視為一個獨立的反應(yīng)器，可實現(xiàn)大規(guī)模的反應(yīng)檢測與篩選�；�于液滴微流控的分選技術(shù)，單次實驗可以處理 106 個漿 B 細胞，且使用的耗材設(shè)計簡單、生產(chǎn)產(chǎn)業(yè)鏈成熟。整體來說，具有通量高、成本低、操作簡單等優(yōu)勢。在單 B 抗體發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域具有巨大潛力。但目前，成熟商業(yè)化的儀器平臺仍然較少，市場潛力有待鋪墊。
Comet 彗星高通量單細胞篩選系統(tǒng)以微液滴作為單 B 細胞檢測的反應(yīng)單元，實現(xiàn)功能性單 B 細胞的高通量篩選。 
1）實驗設(shè)計與方法選擇：選擇合適的方法學(xué)：磁珠法檢測或 FRET 法檢測。
2）細胞包裹：使用液滴生成系統(tǒng)將功能性熒光檢測試劑與 B 細胞包裹成微液滴。
3）液滴孵育和抗體分泌：這個過程中，微液滴中單個 B 細胞能夠產(chǎn)生和分泌一定量的單克隆抗體，抗體與液滴中 B 細胞功能檢測試劑反應(yīng)并產(chǎn)生熒光信號。
4）目標B細胞篩選：使用彗星高通量篩選系統(tǒng)，檢測液滴中反應(yīng)后的熒光信號，對陽性液滴細胞進行高通量分選富集。單次可實現(xiàn)百萬級別單 B 細胞的篩選。
5）BCR測序：篩選后的陽性 B 細胞可進行低通量的 RT-PCR 后接測序從而獲取 BCR 序列。亦可直接在達普自主開發(fā)的 Galaxy 單細胞建庫系統(tǒng)進行高通量單細胞文庫構(gòu)建。
6）目標 VH - VL 序列獲�。焊咄�量測序后，獲得單 B 細胞的 BCR 序列，通過自主開發(fā)的 StarScope 生信分析軟分析拼接，最終獲得輕重鏈配對的抗體序列，用于后期載體構(gòu)建及表達。