細(xì)胞凍存基本流程tips

瀏覽次數(shù)：684　發(fā)布日期：2022-12-28　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

細(xì)胞在正常的生長(zhǎng)活動(dòng)中會(huì)不斷的代謝，需要有各類蛋白酶的參與，當(dāng)?shù)陀?70℃時(shí)蛋白酶就會(huì)停止工作。所以在超低溫的環(huán)境下，可以使細(xì)胞停止代謝活動(dòng)，進(jìn)入休眠狀態(tài)，以便于長(zhǎng)期儲(chǔ)存。

實(shí)驗(yàn)材料

基礎(chǔ)材料：

● 基礎(chǔ)培養(yǎng)基

● 血清（常規(guī)為FBS/NBS）

● 超凈工作臺(tái)

● 無菌二甲基亞砜（DMSO）

● 無菌PBS磷酸鹽緩沖液

● 移液槍

● 電動(dòng)移液槍

耐思相關(guān)耗材：

● PET/PETG方形試劑瓶[NEST]

● 15mL、50mL無菌離心管[NEST]

● 盒裝無菌吸頭[NEST]

● 血清移液管[NEST]

● 杯式濾器(0.22μm PES膜) [NEST]

● 針式濾器 (0.22μm PES膜) [NEST]

● 凍存管[NEST]

● 自動(dòng)旋蓋機(jī)[NEST]

● 程序降溫盒[NEST]

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

● 凍存液準(zhǔn)備：

一般的細(xì)胞：55%基礎(chǔ)培養(yǎng)基+40%牛血清（FBS/NBS）+5%DMSO

重要的細(xì)胞：90%牛血清（FBS/NBS）+10%DMSO

凍存液配置完成后，15ml離心管[NEST]分裝，4℃條件下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩Ｈ襞渲昧枯^大，可分裝入50ml離心管[NEST]，-20℃條件下冷凍儲(chǔ)存。（若牛血清內(nèi)存在析出沉淀物，采用0.22μm 濾膜過濾除菌）

使用前37℃水浴加熱。

● 待凍存細(xì)胞準(zhǔn)備：

使細(xì)胞凍存前，選擇細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，凍存前12~24h換新鮮培養(yǎng)基維持細(xì)胞狀態(tài)。

實(shí)驗(yàn)流程

1、觀察待凍存細(xì)胞密度，約為80%~90%。用移液槍吸出陳舊培養(yǎng)基，加入無菌PBS清洗細(xì)胞1-2次，去除培養(yǎng)環(huán)境中的殘留培養(yǎng)基。

2、加入適量對(duì)應(yīng)胰酶或消化液，使胰酶沒過細(xì)胞，放入培養(yǎng)箱消化。顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間不再連接成片，此時(shí)加入完終止液終止消化。

3、用吸頭輕輕吹打細(xì)胞，形成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液1000rpm，離心3-5min。丟棄上清，加入適量預(yù)先配制好的凍存液，輕輕吹打使細(xì)胞均勻并計(jì)數(shù)。用凍存液調(diào)節(jié)的細(xì)胞密度，使之終密度為5×106/ml～1×107/ml。

4、用移液槍按照預(yù)計(jì)容量，分裝入細(xì)胞凍存管[NEST]中，采用自動(dòng)旋蓋機(jī)[NEST]旋蓋密封。

5、標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序?yàn)榻禍厮俾蕸r處-1℃～-2℃/ min，可將待凍存細(xì)胞按照以下步驟逐步凍存：室溫→4℃（20min）→-20℃（30min）→-80℃（過夜）→液氮長(zhǎng)期保存。

也可將待凍存放入程序降溫盒[NEST]，直接-80℃過夜，再轉(zhuǎn)移至液氮保存。