穩(wěn)定血流誘導(dǎo)的KLK10表達(dá)抑制內(nèi)皮炎癥和動(dòng)脈粥樣硬化

動(dòng)脈粥樣硬化是一種炎癥性疾病，優(yōu)先發(fā)生在暴露于擾動(dòng)血流（d-flow）的動(dòng)脈分支或彎曲區(qū)域，而穩(wěn)定血流（s-flow）的區(qū)域則受到保護(hù)，免受動(dòng)脈粥樣硬化的影響。內(nèi)皮細(xì)胞 （ECs） 在管腔和其表面、細(xì)胞-細(xì)胞連接處和細(xì)胞骨架上配備了幾個(gè)機(jī)械傳感器，可檢測(cè)流體剪切應(yīng)力并觸發(fā)信號(hào)通路和細(xì)胞反應(yīng)的級(jí)聯(lián)。d-流在很大程度上通過(guò)調(diào)節(jié)對(duì)流動(dòng)敏感的編碼基因和非編碼基因以及表觀遺傳修飾因子來(lái)誘導(dǎo)內(nèi)皮功能障礙和動(dòng)脈粥樣硬化。使用動(dòng)脈粥樣硬化和轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的部分頸動(dòng)脈結(jié)扎（PCL）小鼠模型，在ECs中鑒定了數(shù)百個(gè)血流敏感基因，與右頸動(dòng)脈（RCA）中的s-流相比，這些基因通過(guò)左頸動(dòng)脈（LCA）中的d-流而變化。在對(duì)流動(dòng)敏感的基因中，激肽釋放酶10（Klk10）被確定為對(duì)血流最敏感的基因之一，在s-流下具有高表達(dá)，在d-流下低表達(dá)。然而，其在內(nèi)皮功能和動(dòng)脈粥樣硬化中的作用尚不清楚。

KLK10最初被鑒定為正常的上皮細(xì)胞特異性1（NES1）基因，并且是激肽釋放酶相關(guān)肽酶“KLK”家族的成員，該家族由15種分泌絲氨酸蛋白酶組成。KLKs參與各種各樣的過(guò)程，從皮膚脫屑到牙齒發(fā)育，高血壓和癌癥。KLK10最初被發(fā)現(xiàn)是一種潛在的腫瘤抑制因子，其在乳腺癌，前列腺癌，睪丸癌和肺癌中的表達(dá)下調(diào)。然而，進(jìn)一步的研究表明，由于KLK10在卵巢癌，胰腺癌和子宮癌中過(guò)度表達(dá)，因此情況更為復(fù)雜。然而，KLK10對(duì)內(nèi)皮功能和動(dòng)脈粥樣硬化的作用尚不清楚。

在美國(guó)埃默里大學(xué)與佐治亞理工學(xué)院庫(kù)爾特生物醫(yī)學(xué)工程系、中國(guó)北京大學(xué)生物工程系、英國(guó)倫敦帝國(guó)理工學(xué)院化學(xué)系等團(tuán)隊(duì)的一項(xiàng)聯(lián)合研究中，驗(yàn)證了KLK10介導(dǎo)s-流的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用，而d-流條件下KLK10的損失導(dǎo)致促動(dòng)脈粥樣硬化生成作用的假設(shè)。

KLK10在體外和體內(nèi)ECs中通過(guò)s-流增加，d-流降低

為了驗(yàn)證KLK10在體內(nèi)表達(dá)的血流依賴性調(diào)節(jié)，進(jìn)行了小鼠PCL手術(shù)以誘導(dǎo)LCA中的d-流，同時(shí)維持RCA中的s-流（圖1 a）。與 LCA 的 d-flow相比， ECs 中KLK10的蛋白（圖1 b、c）和mRNA表達(dá)（圖1 d）在RCA 的 s-flow 中顯著更高。有趣的是，KLK10蛋白也存在于外膜中，偶爾在內(nèi)皮下層中也觀察到（圖1 b）。此外，KLK10蛋白在較小曲率區(qū)域（LC，自然和長(zhǎng)期暴露于d-流的動(dòng)脈粥樣硬化易發(fā)主動(dòng)脈弓區(qū)域）與較大曲率區(qū)域（GC，自然和長(zhǎng)期暴露于s-流的動(dòng)脈粥樣硬化保護(hù)的主動(dòng)脈弓區(qū)域）相比，表達(dá)降低（圖1 e、f）。

接下來(lái)，將人主動(dòng)脈ECs（HAECs）暴露于單向?qū)恿骷羟校↙S，15 dynes/cm2）或振蕩剪切（OS，±5 dynes/cm2，1 Hz）下24 小時(shí)，分別模擬體內(nèi)的 s-流和 d-流條件，測(cè)試血流是否可以調(diào)節(jié)KLK10的表達(dá)。KLK10 mRNA （圖1 g）、細(xì)胞裂解物中的KLK10蛋白（圖1 h、j），以及條件培養(yǎng)基中的分泌蛋白（圖1 j）被OS降低，LS增加，證實(shí)了KLK10在體內(nèi)和體外作為流動(dòng)敏感基因和蛋白質(zhì)的作用。

通過(guò)重新分析單細(xì)胞 RNA 測(cè)序（scRNAseq）和 scATACseq 數(shù)據(jù)集，進(jìn)一步證實(shí)了 Klk10 的流動(dòng)依賴性表達(dá)。如 scRNAseq 數(shù)據(jù)分析（圖1 k），Klk10轉(zhuǎn)錄本表達(dá)在s-流中最高，對(duì)d-流的反應(yīng)降低。scATACseq 數(shù)據(jù)（圖1 i）表明，Klk10啟動(dòng)子區(qū)域僅在暴露于s-流條件下的EC中是開(kāi)放和可訪問(wèn)的（表明轉(zhuǎn)錄狀態(tài)活躍），但在d-流條件和所有其他非EC類型的EC中是封閉和不可訪問(wèn)的（表明轉(zhuǎn)錄狀態(tài)不活躍）。這些結(jié)果表明，Klk10表達(dá)在表觀基因組和轉(zhuǎn)錄組水平上受到EC中血流的有效調(diào)節(jié)，支持上述體外和體內(nèi)結(jié)果（圖1 b-g）。
 

圖1   在體外和體內(nèi)，內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）中KLK10表達(dá)被擾動(dòng)流（d-flow）抑制，穩(wěn)定流（s-flow）升高。

 

KLK10抑制內(nèi)皮炎癥并保護(hù)通透性屏障

接下來(lái)，通過(guò)評(píng)估KLK10在內(nèi)皮炎癥反應(yīng)，管形成，遷移，增殖和凋亡中的作用來(lái)測(cè)試KLK10是否調(diào)節(jié)EC功能，這些作用在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用。rKLK10對(duì)人臍靜脈ECs（HUVECs）的遷移和管形成可顯著抑制，但不能抑制增殖和凋亡（圖2）。此外，rKLK10以濃度依賴性方式顯著抑制單核細(xì)胞對(duì)ECs的粘附（圖2 b）。值得注意的是，如果加熱rKLK10，rKLK10的抗炎作用就會(huì)喪失，這意味著KLK10的酶活性或天然構(gòu)象的重要性（圖2 b）。此外，rKLK10處理顯著抑制促炎粘附分子VCAM1和ICAM1的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)（圖2 c-g）。

然后，測(cè)試了KLK10在體外和體內(nèi)流動(dòng)條件下對(duì)內(nèi)皮炎癥反應(yīng)的影響。rKLK10 處理抑制 OS 誘導(dǎo)的 HAECs 中的單核細(xì)胞粘附（圖2 h）。相反，siRNA介導(dǎo)的KLK10敲低在LS條件下顯著增加了單核細(xì)胞的粘附（圖2 i）。接下來(lái)測(cè)試了rKLK10是否也可以抑制小鼠主動(dòng)脈弓流動(dòng)紊亂的LC中的內(nèi)皮炎癥。結(jié)果表明，rKLK10顯著降低了這些小鼠主動(dòng)脈弓d-流（LC）區(qū)域中VCAM1的表達(dá)（圖2 j、k）。這些結(jié)果表明，在TNFα或d-flow條件下，使用質(zhì)粒或rKLK10處理的KLK10過(guò)表達(dá)在體外和體內(nèi)均可防止EC炎癥，而通過(guò)d-flow或KLK10 mRNA敲低來(lái)降低KLK10的表達(dá)會(huì)增加炎癥。

圖2   KLK10在體外和體內(nèi)抑制內(nèi)皮細(xì)胞炎癥。

 

由于NFκB是一種眾所周知的促炎轉(zhuǎn)錄因子，其誘導(dǎo)VCAM1和ICAM1的表達(dá)以及隨后單核細(xì)胞對(duì)ECs的粘附，因此測(cè)試了KLK10是否抑制NF-κB活化以響應(yīng)剪切應(yīng)力和TNFα。實(shí)驗(yàn)首先發(fā)現(xiàn)KLK10阻止了磷酸化（p-Ser536）和p65的跨核定位，這是NFκB活化的兩個(gè)重要標(biāo)志物。KLK10還利用LS條件阻止p65的跨核定位以響應(yīng)急性剪切力刺激。

接下來(lái)測(cè)試了rKLK10處理是否可以保護(hù)ECs的滲透性屏障功能。作為陽(yáng)性對(duì)照，凝血酶處理增加了HAECs的滲透性。rKLK10預(yù)處理阻止了凝血酶在HAECs中誘導(dǎo)的通透性增加（圖3 a、b）。同樣，rKLK10降低了OS引起的滲透率（圖3 c、d）。這些結(jié)果證明了，KLK10在內(nèi)皮炎癥和屏障功能中的保護(hù)作用。
 

圖3   KLK10保護(hù)內(nèi)皮通透性免受凝血酶和振蕩剪切（OS）的影響。

 

rKLK10處理可抑制Apoe^−/− 小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化

鑒于rKLK10在ECs中的抗炎和屏障保護(hù)作用，實(shí)驗(yàn)測(cè)試了是否可以通過(guò)用rKLK10處理小鼠來(lái)預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。通過(guò)尾靜脈注射rKLK10顯著減少LCA中的動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展和巨噬細(xì)胞積累。rKLK10處理顯示對(duì)血漿總膽固醇、LDL（低密度脂蛋白）和HDL（高密度脂蛋白）膽固醇和甘油三酯沒(méi)有影響。因此，rKLK10在體內(nèi)顯示出抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。

 

超聲介導(dǎo)的KLK10過(guò)表達(dá)抑制Apoe^−/− 小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化

接下來(lái)，使用質(zhì)粒載體過(guò)表達(dá)KLK10是否也可以抑制體內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化。與對(duì)照組相比，KLK10過(guò)表達(dá)小鼠LCA中動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成顯著減少。通過(guò)蘇木精和伊紅組織化學(xué)染色進(jìn)一步評(píng)估頸動(dòng)脈切片，顯示這些小鼠LCA中的斑塊面積減少。處死時(shí)用ELISA測(cè)量的小鼠循環(huán)血漿KLK10水平顯示熒光素酶組和KLK10組之間沒(méi)有可測(cè)量的差異。這可能是由于處死時(shí)質(zhì)粒表達(dá)減弱。然而，發(fā)現(xiàn)LCA和RCA的內(nèi)皮層的KLK10染色水平較高，蛋白質(zhì)印跡顯示肺組織樣本中也有KLK10染色。實(shí)驗(yàn)觀察到，血漿總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白和非高密度脂蛋白在KLK10注射的小鼠中與對(duì)照小鼠相比沒(méi)有顯著差異。這些結(jié)果表明，通過(guò)rKLK10或KLK10表達(dá)載體處理KLK10都可以抑制Apoe^−/− 小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。

 

KLK10在伴有晚期動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的人冠狀動(dòng)脈中表達(dá)降低

最后，實(shí)驗(yàn)檢查了KLK10在具有不同程度動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的人冠狀動(dòng)脈組織切片中的表達(dá)是否改變。KLK10和CD31免疫染色表明，KLK10 表達(dá)在斑塊明顯的動(dòng)脈內(nèi)皮層（4-6級(jí)，圖4 a、b），比病變較輕的動(dòng)脈（1-3級(jí)）明顯降低。

圖4   KLK10在具有晚期動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的人冠狀動(dòng)脈中表達(dá)降低。

 

圖5   對(duì)血流敏感的KLK10可抑制內(nèi)皮炎癥并保護(hù)通透性屏障，最終減少動(dòng)脈粥樣硬化。

 

KL10在基因組和蛋白質(zhì)水平上被s-流上調(diào)，被d-流下調(diào)。在KLK10表達(dá)較高的s-流條件下，KLK10抑制NFκB以及血管細(xì)胞粘附分子1（VCAM1）和細(xì)胞內(nèi)粘附分子1（ICAM1）的表達(dá)，從而阻止單核細(xì)胞粘附。此外，由 s-flow 產(chǎn)生的 KLK10 可保護(hù)內(nèi)皮通透性屏障�？傊�，KLK10的抗炎和屏障保護(hù)作用導(dǎo)致對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的整體保護(hù)。

 

總之，該研究證明了KLK10是一種對(duì)流動(dòng)敏感的蛋白質(zhì)，在ECs中被s-flow上調(diào)，被d-flow下調(diào)。結(jié)果還表明，KLK10是ECs 中s-flow以自分泌方式抗炎、屏障保護(hù)和抗動(dòng)脈粥樣硬化作用的有效中介（圖5）。KLK10可作為潛在的抗動(dòng)脈粥樣硬化治療靶點(diǎn)。

 

參考文獻(xiàn)：Williams D, Mahmoud M, Liu R, Andueza A, Kumar S, Kang DW, Zhang J, Tamargo I, Villa-Roel N, Baek KI, Lee H, An Y, Zhang L, Tate EW, Bagchi P, Pohl J, Mosnier LO, Diamandis EP, Mihara K, Hollenberg MD, Dai Z, Jo H. Stable flow-induced expression of KLK10 inhibits endothelial inflammation and atherosclerosis. Elife. 2022 Jan 11;11:e72579. doi: 10.7554/eLife.72579. PMID: 35014606; PMCID: PMC8806187.

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35014606/

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