單細(xì)胞分析揭示的動(dòng)脈粥樣硬化內(nèi)皮細(xì)胞的新型表型調(diào)節(jié)因子-SOX4

動(dòng)脈粥樣硬化是一種進(jìn)行性血管疾病，其特征是在動(dòng)脈內(nèi)膜積聚的脂質(zhì)、形成纖維脂質(zhì)斑塊致管壁增厚、管腔狹窄。內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）的單層構(gòu)成血管的內(nèi)膜，負(fù)責(zé)生物力學(xué)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)和血管張力的調(diào)節(jié)。ECs功能障礙以內(nèi)皮依賴性血管擴(kuò)張和血管收縮不平衡為特征，提示動(dòng)脈粥樣硬化性病變的起始。然而，動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中ECs的詳細(xì)轉(zhuǎn)錄圖譜、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子特征尚不完全清楚。

慢性血管炎癥提供了一個(gè)促動(dòng)脈粥樣硬化的微環(huán)境，不斷刺激ECs，而這種不利條件與西方飲食的增加有關(guān)。在這種微環(huán)境中，分泌的細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）的存在促使ECs的表型轉(zhuǎn)變。這種表型改變稱為內(nèi)皮到間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EndoMT），間充質(zhì)樣ECs逐漸表達(dá)VSMC標(biāo)志物，從而加重動(dòng)脈硬化。

此外，血管ECs不斷暴露于血流產(chǎn)生的機(jī)械刺激（即剪切應(yīng)力），其中不同的剪切模式觸發(fā)不同的細(xì)胞反應(yīng)。穩(wěn)定層流剪切應(yīng)力（LSS）可引起抗炎和抗動(dòng)脈粥樣硬化作用，振蕩剪切應(yīng)力（OSS）則對(duì)應(yīng)于促炎和促動(dòng)脈粥樣硬化作用。然而，很少有研究將成熟和功能性ECs與間充質(zhì)樣ECs的遺傳特征進(jìn)行比較，特別是在動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的背景下。
 

在香港中文大學(xué)李嘉誠(chéng)健康科學(xué)研究所、香港中文大學(xué)生物醫(yī)學(xué)學(xué)院、國(guó)家衛(wèi)生研究院細(xì)胞與系統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究所的一項(xiàng)研究中，應(yīng)用scRNA-seq方法（i）探索動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中主動(dòng)脈ECs的轉(zhuǎn)錄景觀和異質(zhì)性；（ii）在功能失調(diào)的ECs中鑒定新的和可成藥的分子靶點(diǎn)；（iii）將新確定的分子靶點(diǎn)與血管系統(tǒng)的病理狀況聯(lián)系起來(lái)；以及（iv）將實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)現(xiàn)與人類動(dòng)脈粥樣硬化疾病臨床標(biāo)本中的動(dòng)脈和ECs相關(guān)聯(lián)。研究結(jié)果將為確定針對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化疾病的替代治療策略開(kāi)辟新的機(jī)會(huì)。以下為部分研究成果分享。
 

SOX4 在動(dòng)脈粥樣硬化性主動(dòng)脈中上調(diào)

由于轉(zhuǎn)錄因子（TFs）代表了真核細(xì)胞中各種信號(hào)通路的匯合點(diǎn)，因此直接調(diào)節(jié)TFs功能可能為不同疾病（包括動(dòng)脈粥樣硬化）提供新的治療見(jiàn)解。在動(dòng)脈粥樣硬化主動(dòng)脈中，僅在EC和VSMC簇中檢測(cè)到TF Sox4的上調(diào)（圖1 A）。盡管在動(dòng)脈粥樣硬化主動(dòng)脈的EC中也注意到Tcf4上調(diào)（圖1 A），但其在多個(gè)細(xì)胞簇中的復(fù)雜表達(dá)變化表明，Tcf4可能參與多個(gè)細(xì)胞過(guò)程，但不僅僅參與動(dòng)脈粥樣硬化期間的EC功能。為了解開(kāi)這些TFs下游的效應(yīng)基因，進(jìn)行了相互作用組分析。此外，SOX4是某些間充質(zhì)標(biāo)志物（即VIM和FN1）的直接上游調(diào)節(jié)因子，如基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析所示（圖1 B）。在WD喂養(yǎng)的ApoE^−/− 小鼠主動(dòng)脈根部和人動(dòng)脈粥樣硬化冠狀動(dòng)脈和腎動(dòng)脈中，分別在斑塊區(qū)和EC層觀察到SOX4上調(diào)（圖1 C、E）。這種上調(diào)伴隨著小鼠主動(dòng)脈和人動(dòng)脈粥樣硬化腎動(dòng)脈分離的ECs中內(nèi)皮標(biāo)志物（即eNOS和PECAM-1）的丟失和間充質(zhì)標(biāo)志物（即VIM）的增加（圖1 D、F）。
 

圖1   人和小鼠動(dòng)脈粥樣硬化主動(dòng)脈中的內(nèi)皮SOX4上調(diào)。

（A）不同主動(dòng)脈細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子Sox4和Tcf4表達(dá)的圖。（B）SOX4與其他蛋白質(zhì)相互作用組的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析。（C）動(dòng)脈粥樣硬化病變上的油紅O染色和ApoE-/- 小鼠主動(dòng)脈根部SOX4表達(dá)的免疫組織化學(xué)染色。（D）來(lái)自ApoE−/− 小鼠分離的ECs的SOX4，內(nèi)皮標(biāo)志物（即eNOS和PECAM-1）和間充質(zhì)標(biāo)志物（即VIM）的蛋白質(zhì)印跡表達(dá)水平。（E）人患病冠狀動(dòng)脈和對(duì)照胸內(nèi)動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中SOX4的免疫熒光染色水平。（F）人腎動(dòng)脈內(nèi)皮（PECAM-1）和間充質(zhì)（VIM）標(biāo)志物水平的免疫熒光染色。ND：正常飲食；WD：西方飲食。

 

SOX4過(guò)表達(dá)的促動(dòng)脈粥樣硬化和促EndoMT 效應(yīng)

為了了解SOX4在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用，在WD喂養(yǎng)前，將內(nèi)皮特異性AAV-SOX4注射到ApoE−/− 小鼠。結(jié)果表明，SOX4過(guò)表達(dá)增加了ApoE−/− 小鼠主動(dòng)脈中SOX4蛋白的表達(dá)（圖2 A）。SOX4過(guò)表達(dá)增加了ApoE−/− 小鼠面主動(dòng)脈和主動(dòng)脈根部的病變區(qū)域（圖2 B、C）。此外，SOX4過(guò)表達(dá)導(dǎo)致分離的ECs和主動(dòng)脈根部的內(nèi)皮標(biāo)志物（即eNOS和PECAM-1）丟失和間充質(zhì)標(biāo)志物（即VIM）的增加（圖2 A、D）。而且，體外腺病毒介導(dǎo)的SOX4過(guò)表達(dá)在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）和人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（HAECs）中引起類似的結(jié)果（圖2 E-G）。與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)一致（圖1 B），SOX4過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了ECs中的VIM水平。

此外，實(shí)驗(yàn)還研究了SOX4過(guò)表達(dá)對(duì)ECs形態(tài)和功能的影響。這種過(guò)表達(dá)觸發(fā)了HUVECs和HAECs的伸長(zhǎng)（圖2 H），以及小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性松弛的損害（圖2 I），表示結(jié)構(gòu)改變和內(nèi)皮功能障礙。這些證據(jù)暗示了SOX4的促動(dòng)脈粥樣硬化作用，這與SOX4介導(dǎo)的EndoMT有關(guān)。

圖2   SOX4在內(nèi)皮細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)。

（A）ApoE−/− 小鼠分離的ECs的蛋白質(zhì)印跡，先前接受尾靜脈注射內(nèi)皮特異性AAV-SOX4。（B、C）注射AAV-SOX4的ApoE−/− 小鼠的（B）面主動(dòng)脈和（C）主動(dòng)脈根部動(dòng)脈粥樣硬化病變的油紅色O染色。（D）小鼠主動(dòng)脈根部?jī)?nèi)皮和間充質(zhì)標(biāo)志物的免疫熒光染色。（E、F）在 Ad-SOX4 處理的（E）HUVECs 和（F）HAECs 上進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。（G）對(duì)Ad-SOX4感染的HUVECs的內(nèi)皮和間充質(zhì)標(biāo)志物進(jìn)行免疫熒光染色。（H）經(jīng)Ad-SOX4處理的HUVECs的形態(tài)。（I）通過(guò)線肌圖對(duì)Ad-SOX4感染的C57BL / 6小鼠主動(dòng)脈進(jìn)行內(nèi)皮依賴性松弛的功能測(cè)定。

 

二甲雙胍抑制細(xì)胞因子介導(dǎo)的SOX4上調(diào)

接下來(lái)，實(shí)驗(yàn)旨在揭示SOX4的潛在誘導(dǎo)因子和抑制因子。值得注意的是，西方飲食模式通常與更高水平的循環(huán)細(xì)胞因子（例如IL-1β）相關(guān)，IL-1β和TGF-β1都是動(dòng)脈粥樣硬化期間EndoMT誘導(dǎo)的細(xì)胞因子。此外，SOX4先前已被證明是免疫細(xì)胞（例如T細(xì)胞）中這兩種細(xì)胞因子的下游靶點(diǎn)。因此，實(shí)驗(yàn)想知道IL-1β和TGF-β1是否作為內(nèi)皮細(xì)胞中SOX4介導(dǎo)的EndoMT的上游啟動(dòng)因子。事實(shí)上，用IL-1β（10 ng ml−1）進(jìn)行體外孵育可誘導(dǎo)人腎動(dòng)脈和 ApoE−/− 小鼠主動(dòng)脈中的 SOX4 上調(diào)和 EndoMT（圖3 A-C）。然后進(jìn)一步驗(yàn)證了暴露于IL-1β和TGF-β1（另一種EndoMT誘導(dǎo)細(xì)胞因子）的HUVECs的結(jié)果。兩種細(xì)胞因子的共同處理顯著增加了HUVECs中的SOX4蛋白表達(dá)和EndoMT（圖3 D）。更重要的是，用抗糖尿病藥物二甲雙胍處理，先前報(bào)道是癌中的 SOX4抑制劑，逆轉(zhuǎn)了細(xì)胞因子誘導(dǎo)的HUVECs中SOX4表達(dá)和EndoMT的升高（圖3 D）。更重要的是，siRNA介導(dǎo)的SOX4敲低也逆轉(zhuǎn)了HUVECs中細(xì)胞因子誘導(dǎo)的EndoMT（圖3 E）。
 

圖3   SOX4上調(diào)的生化誘導(dǎo)因子。

（A）IL-1β處理的人腎動(dòng)脈SOX4表達(dá)的免疫組織化學(xué)染色。（B）IL-1β處理的人腎動(dòng)脈上的蛋白質(zhì)印跡。（C）IL-1β 處理的 ApoE−/− 小鼠主動(dòng)脈的蛋白質(zhì)印跡。（D）二甲雙胍在IL-1β和TGF-β1共同處理的HUVECs中的影響。（E）siRNA介導(dǎo)的SOX4敲低在IL-1β和TGF-β1共同處理的HUVECs中的影響。

 

OSS 誘導(dǎo)的 SOX4 上調(diào)

動(dòng)脈粥樣硬化斑塊和動(dòng)脈瘤往往發(fā)生在暴露于血流紊亂的血管區(qū)域。由于OSS經(jīng)歷區(qū)域（例如小鼠主動(dòng)脈根部）中的SOX4表達(dá)很高（圖1 C），實(shí)驗(yàn)假設(shè)除了細(xì)胞因子介導(dǎo)的生化刺激外，SOX4可能對(duì)血流誘導(dǎo)的機(jī)械刺激敏感。由于相對(duì)直的TA和彎曲的AA分別對(duì)應(yīng)于LSS（12 dyn cm2）和OSS（0.5 ± 6 dyn cm2，1 Hz）（圖4 A），實(shí)驗(yàn)檢查了這些血管區(qū)域的SOX4水平。位于AA內(nèi)曲率的ECs中的SOX4表達(dá)增加（圖4 B），同時(shí)AA的整體SOX4表達(dá)也較高（圖4 C）。然后進(jìn)一步驗(yàn)證了在體外受血流動(dòng)力學(xué)力作用的HUVECs的結(jié)果（圖4 D）。暴露于OSS（0.5 ± 6 dyn cm2，1 Hz）24小時(shí)后，HUVECs的SOX4水平在轉(zhuǎn)錄和翻譯上均升高（圖4 E），與體內(nèi)結(jié)果一致。
 

圖4   SOX4上調(diào)的生物力學(xué)誘導(dǎo)因子。

（A）沿主動(dòng)脈的不同流動(dòng)模式示意圖。（B）小鼠胸主動(dòng)脈（TA）和主動(dòng)脈弓（AA）的面部SOX4表達(dá)的免疫熒光染色。（C）小鼠TA和AA中SOX4水平的蛋白質(zhì)印跡。（D）流動(dòng)系統(tǒng)設(shè)計(jì)示意圖和細(xì)胞室橫截面。（E）暴露于LSS或OSS 24小時(shí)的HUVECs中SOX4水平的蛋白質(zhì)印跡。
 

圖5   圖形概要

高脂血癥相關(guān)的細(xì)胞因子和紊亂的血流上調(diào)ECs中SOX4的表達(dá)，其中SOX4促進(jìn)EndoMT和動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生。 二甲雙胍在藥理學(xué)上抑制ECs中的SOX4水平。

 

綜上所述，該研究揭示了小鼠動(dòng)脈粥樣硬化主動(dòng)脈的細(xì)胞組成和轉(zhuǎn)錄譜，并根據(jù)轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞異質(zhì)性將ECs分為兩個(gè)亞群。此外，SOX4被成功鑒定為人類和小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的新標(biāo)志物。高脂血癥相關(guān)細(xì)胞因子和流體剪切應(yīng)力被確定為介導(dǎo)SOX4上調(diào)的上游刺激，從而為SOX4加速動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展提供了機(jī)制見(jiàn)解。二甲雙胍被證明可以抑制細(xì)胞因子誘導(dǎo)的SOX4上調(diào)，為動(dòng)脈粥樣硬化疾病開(kāi)辟了新的治療機(jī)會(huì)。

 

參考文獻(xiàn)：Cheng CK, Lin X, Pu Y, Tse JKY, Wang Y, Zhang CL, Cao X, Lau CW, Huang J, He L, Luo JY, Shih YT, Wan S, Ng CF, Wang L, Ma RCW, Chiu JJ, Chan TF, Yu Tian X, Huang Y. SOX4 is a novel phenotypic regulator of endothelial cells in atherosclerosis revealed by single-cell analysis. J Adv Res. 2023 Jan;43:187-203. doi: 10.1016/j.jare.2022.02.017. Epub 2022 Mar 1. PMID: 36585108.

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36585108/

 

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