植物表型成像技術(shù)應(yīng)用：植物病害表型組學(xué)分析（一）

      自然界中的植物都會面臨各種病害的侵染。病害防治更是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的重中之重�？茖W(xué)家們一直致力于用各種技術(shù)研究植物病害的發(fā)病機(jī)制和防治方法。在近年的最新研究中，新興的組學(xué)研究技術(shù)逐漸成為病害研究的熱點(diǎn)。在各種組學(xué)技術(shù)中，從直觀、無損、快速、簡便以及農(nóng)業(yè)應(yīng)用推廣上考慮，植物表型成像分析技術(shù)無疑是最優(yōu)的選擇之一。       傳統(tǒng)表型概念里以形態(tài)學(xué)指標(biāo)為主。而現(xiàn)代植物表型成像分析技術(shù)已經(jīng)不局限于形態(tài)學(xué)，其主要應(yīng)用的成像技術(shù)如下，它們在植物病害研究分別反映植物的不同表型變化與生理過程：
 

技術(shù)類別	表型與生理過程	病害研究用途	常用參數(shù)指標(biāo)
葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)	植物光合能力、光合電子傳遞鏈、光系統(tǒng)熱耗散等光合生理過程	評估病害對光合系統(tǒng)損傷程度與機(jī)制；由于光系統(tǒng)對脅迫的敏感性，是病害早期預(yù)警的最靈敏且最常用技術(shù)之一	最大光化學(xué)效率Fv/Fm、實(shí)際光化學(xué)效率QY、非光化學(xué)淬滅系數(shù)NPQ、熒光衰減率“活力指數(shù)”Rfd等
UV-MCF紫外激發(fā)多光譜熒光成像技術(shù)	植物在病斑及周邊區(qū)域合成大量黃酮、多酚類次生代謝物，以防御病害的擴(kuò)散	通過測量次生代謝物熒光，評估病害的發(fā)生程度與植物防御機(jī)制的激活	次生代謝物熒光F440、F520；葉綠素?zé)晒釬690、F740
形態(tài)成像分析技術(shù)	株高、株寬、葉面積、生物量、生長動態(tài)、色彩變化等形態(tài)的影響	評估不同條件下對植物形態(tài)的影響乃至增產(chǎn)效應(yīng)	株高、葉面積及病斑面積、數(shù)字生物量等
多/高光譜（反射光譜）成像分析技術(shù)	通過反射光譜的變化定量反映植物活力、色素組成、光合作用、生化組成、氮素營養(yǎng)、水分含量等表型生理，對病害的影響進(jìn)行間接測量。	病害對從健康程度、色素組成、營養(yǎng)狀況等方面的影響，同時(shí)也配合葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)對病害抗性進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。	歸一化植被指數(shù)NDVI、光化學(xué)反射指數(shù)PRI、花青素反射指數(shù)ARI、胡蘿卜素反射指數(shù)CRI等
紅外熱成像技術(shù)	獲得植物表面溫度分布圖及溫度數(shù)據(jù)	通過葉片溫度反映由于病害導(dǎo)致的葉片氣孔導(dǎo)度變化、代謝紊亂等	平均溫度、溫度范圍、水脅迫指數(shù)I

 
      植物病害的病原體有病毒、細(xì)菌、真菌。而植物種類又有模式植物、谷物、蔬菜、水果等。植物表型成像分析技術(shù)能夠應(yīng)對這些不同的研究需求嗎？我們從具體的文獻(xiàn)案例里查找答案，本期主要介紹關(guān)于抗病毒基因、蔬菜水果的葉片細(xì)菌病害相關(guān)研究案例：

一、利用模式植物研究抗病毒基因
      法國國家農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院（INRA）的Jean-Luc Gallois研究團(tuán)隊(duì)一直致力于馬鈴薯y病毒組的抗病基因研究。這一病毒組中包括蕪菁花葉病毒(TuMV)、西瓜花葉病毒(WMV)、三葉草黃脈病毒(ClYVV)等重要的農(nóng)作物病毒。這方面研究的難點(diǎn)在于如何直觀、定量地測量病毒在植物樣品上的分布與積累。FluorCam多光譜熒光成像技術(shù)的出現(xiàn)解決了這一難題。FluorCam多光譜熒光成像技術(shù)僅能進(jìn)行了葉綠素?zé)晒獬上駵y量，也提供了關(guān)鍵的GFP標(biāo)記病毒活體成像圖。GFP成像圖直觀地表現(xiàn)病毒量的差異，反映了不同基因功能對擬南芥病毒抗性的影響。同時(shí)，葉綠素?zé)晒獬上駝t反映病毒對光合系統(tǒng)的損傷，可以同步提供病害光合表型信息。
      法國國家農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院利用FluorCam封閉式熒光成像系統(tǒng)，從2015年起發(fā)表了一系列相關(guān)文章，研究方向包括病毒的TOR信號調(diào)控、跨物種合成eIF4E1等位基因獲得病毒抗性、利用CRISPR-Cas9 base editing基因編輯技術(shù)模仿eIF4E自然多態(tài)性與病毒抗性的關(guān)系、擬南芥敲除eIF4E1獲得ClYVV抗性但又與TuMV的敏感性相關(guān)等。       雖然GFP活體成像技術(shù)一般不歸于植物表型成像技術(shù)中，但在病害研究中會經(jīng)常利用帶GFP標(biāo)記的病原體來定量分析感染面積與病毒積累量。FluorCam多光譜熒光成像技術(shù)的GFP活體成像功能也廣泛應(yīng)用與其他病原體的指示測量。
 
參考文獻(xiàn)：
1.Zafirov D, et al. 2021. When a knockout is an Achilles' heel: Resistance to one potyvirus species triggers hypersusceptibility to another one in Arabidopsis thaliana. Mol Plant Pathol. 22: 334–347
2.Bastet A, et al. 2019. Mimicking natural polymorphism in eIF4E by CRISPR‐Cas9 base editing is associated with resistance to potyviruses. Plant Biotechnology Journal 17: 1736–1750
3.Bastet A, et al. 2018. Trans-species synthetic gene design allows resistance pyramiding and broad-spectrum engineering of virus resistance in plants. Plant Biotechnology Journal: 1–13
4.Qin Y, et al. 2019. Purification and Characterization of a Secretory Alkaline Metalloprotease with Highly Potent Antiviral Activity from Serratia marcescens Strain S3. Journal of Agricultural and Food Chemistry 67(11): 3168-3178
 
二、病害快速無損檢測與抗性品種鑒定
      對植物病害進(jìn)行快速檢測與早期預(yù)警，無損快速的植物表型成像技術(shù)無疑是不二之選。但植物表型組的相關(guān)參數(shù)至少有幾十項(xiàng)，哪一項(xiàng)才是最靈敏和最準(zhǔn)確的呢？很多科學(xué)家都進(jìn)行了相關(guān)的探索。
      德國萊布尼茨蔬菜和觀賞植物研究所IGZ將剛發(fā)芽的生菜幼苗感染了立枯絲核菌（Rhizoctonia solani），之后使用多種表型成像分析技術(shù)測試了各種不同參數(shù)，試圖確定哪些技術(shù)的哪個(gè)參數(shù)能夠更靈敏地將感染病害的植株和未感染的植株區(qū)分開。
研究中進(jìn)行成像分析的參數(shù)與所屬技術(shù)如下：
1.葉綠素?zé)晒獬上瘢篎o、Fp、Ft、Fv、最大光化學(xué)效率Fv/Fm、熒光衰減比率Rfd、光合有效葉面積日相對生長速率A_abs和A_rel
2.UV-MCF多光譜熒光成像：F440、F520、F690、F740及各個(gè)參數(shù)之間的比值
3.紅外熱成像：作物水脅迫指數(shù)I1、I2、I3、平均溫度、中值溫度、溫度范圍
4.反射光譜成像：R_NIR、R_RED、歸一化植被指數(shù)NDVI 
      成像技術(shù)的另一個(gè)優(yōu)勢就是可以同時(shí)測量幾十株乃至上百株幼苗樣品，通過配套軟件就能夠簡便地去除圖像中的背景，自動計(jì)算相應(yīng)的參數(shù)。
      更為方便的是，一臺加裝紅外熱成像模塊的FluorCam多光譜熒光成像系統(tǒng)就可以完成所有上述參數(shù)的測量與成像。
        測試結(jié)果發(fā)現(xiàn)，感染病害的植株和未感染的植株之間，最大光化學(xué)效率Fv/Fm、熒光衰減比率Rfd、歸一化植被指數(shù)NDVI、作物水脅迫指數(shù)I1、光合有效葉面積日相對生長速率A_rel、多光譜熒光F440、F520等參數(shù)都表現(xiàn)出顯著差異。通過進(jìn)一步數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析最終發(fā)現(xiàn)最大光化學(xué)效率Fv/Fm、熒光衰減比率Rfd在本次實(shí)驗(yàn)中的識別效果最好，誤差≤0.052。Fv/Fm＞0.73的生菜幼苗即可認(rèn)為是健康的。Fv/Fm甚至能夠在病害癥狀發(fā)生前即可檢測到病菌感染。研究者希望通過進(jìn)一步工作，將這一發(fā)現(xiàn)應(yīng)用于園藝和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐，比如優(yōu)良抗病蔬菜品種的選育、病害的早期發(fā)現(xiàn)與防治等。
        浙江大學(xué)同時(shí)使用FluorCam熒光成像系統(tǒng)對柑橘黃龍病進(jìn)行了檢測分析。研究者通過對健康葉片、感染黃龍病葉片和養(yǎng)分缺乏葉片進(jìn)行葉綠素?zé)晒獬上穹治�，確定了黃龍病獨(dú)一無二的熒光標(biāo)志，即“光合指紋”，結(jié)合葉綠素?zé)晒鈪��?shù)與成像圖，對葉片黃龍病取得了最佳識別分類效果，準(zhǔn)確率達(dá)到97%。
   
參考文獻(xiàn)：
1.Sandmann M, et al. 2018. The use of features from fluorescence, thermography and NDVI imaging to detect biotic stress in lettuce. Plant Disease 102: 1101-1107
2.Weng H, et al. 2020. Characterization and detection of leaf photosynthetic response to citrus Huanglongbing from cool to hot seasons in two orchards. Transactions of the ASABE 63(2): 501-512
 
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9.PhenoTron®-XYZ表型成像分析系統(tǒng)