拉曼光譜儀在細(xì)胞灌流培養(yǎng)中實(shí)現(xiàn)細(xì)胞密度的在線自動化控制

1背景

來自于匈牙利的團(tuán)隊(duì)使用了一種創(chuàng)新的基于拉曼光譜的監(jiān)控系統(tǒng)，用于設(shè)計(jì)動態(tài)補(bǔ)料策略，使中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)培養(yǎng)中關(guān)鍵細(xì)胞營養(yǎng)物質(zhì)維持在理想水平。針對葡萄糖、乳酸和16個單個氨基酸建立的偏最小二乘校準(zhǔn)模型具有很好的預(yù)測能力，均方根誤差值低，平方相關(guān)系數(shù)高。所開發(fā)的用于實(shí)時測量營養(yǎng)物質(zhì)和副產(chǎn)品濃度的模型，使研究人員能夠更好地了解細(xì)胞的代謝行為和營養(yǎng)物質(zhì)的消耗。

 

為了細(xì)胞建立更有益的營養(yǎng)環(huán)境，結(jié)合拉曼模型（葡萄糖和精氨酸）的預(yù)測，采用了兩種動態(tài)補(bǔ)料策略來控制兩部分多組分（two-part multi-component ）培養(yǎng)基的添加。因此，營養(yǎng)物質(zhì)能（葡萄糖和氨基酸）保持在相對穩(wěn)定的水平，而不是高波動，這為細(xì)胞提供了一個更平衡的環(huán)境。此外，與葡萄糖動態(tài)補(bǔ)料培養(yǎng)相比，基于氨基酸的補(bǔ)料控制可以防止?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)過量，并顯著減少培養(yǎng)基的供給，具有經(jīng)濟(jì)效益。

 

2材料

2.1細(xì)胞系

使用表達(dá)阿達(dá)木單抗（Abbvie）的CHO-DG44細(xì)胞系進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。

2.2反應(yīng)器與條件

生物反應(yīng)器培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)在2L工作體積的Applikon玻璃生物反應(yīng)器中進(jìn)行，目標(biāo)初始密度為5×10⁵個細(xì)胞mL^-1。使用Ez控制系統(tǒng)（Applikon Biotechnology）在所需設(shè)定點(diǎn)控制以下工藝參數(shù)：攪拌速度（120 rpm）、溫度（37℃）、DO（40%）和pH（7.1）。利用BioXpert軟件，通過局域網(wǎng)連接，每10 min采集一次培養(yǎng)參數(shù)。

2.3拉曼光譜收集

在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，使用Kaiser raman RXN2 Hybrid system收集拉曼光譜，使用不銹鋼浸沒式MR探頭通過光纖收集拉曼信號，拉曼探頭在高壓滅菌培養(yǎng)前與生物反應(yīng)器一起進(jìn)行滅菌。光譜采集范圍為200-1890cm⁻¹，分辨率為1cm⁻¹。采集的系統(tǒng)設(shè)置為75次曝光次數(shù)，曝光時間為10秒。生物反應(yīng)器覆蓋鋁箔以保護(hù)其免受光。

2.4模型處理

利用化學(xué)計(jì)量學(xué)工具分析拉曼監(jiān)測過程中生成的大型多維數(shù)據(jù)集，并提取相關(guān)的過程信息。采用PLS回歸方法，通過將拉曼光譜（作為獨(dú)立的X變量）與其對應(yīng)的離線測量參考濃度（作為因Y變量）聯(lián)系起來，建立了葡萄糖、乳酸和氨基酸組分的校準(zhǔn)模型。

2.5補(bǔ)料

在生物反應(yīng)器中添加補(bǔ)料溶液以補(bǔ)充細(xì)胞的營養(yǎng)物質(zhì)：兩部分多組分補(bǔ)料培養(yǎng)基（ActiCHO Feed A and Feed B，GE Healthcare）和400 g L^-1葡萄糖（Sigma-Aldrich）原液。

2.6兩種補(bǔ)料策略

采用兩種基于葡萄糖和精氨酸的動態(tài)補(bǔ)料策略，使細(xì)胞的營養(yǎng)物質(zhì)保持在所需的濃度。在以葡萄糖為基礎(chǔ)的動態(tài)補(bǔ)料實(shí)驗(yàn)中，基于拉曼監(jiān)測的葡萄糖濃度（GLC）來控制營養(yǎng)補(bǔ)充。如果GLC低于11 mM的設(shè)定值，則使用兩部分多組分補(bǔ)料培養(yǎng)基（Feed A和Feed B）進(jìn)行補(bǔ)料，以將葡萄糖限制在11 mM的低水平。除此之外，不需要額外的葡萄糖。因此，雙組分飼料培養(yǎng)基中所含的所有營養(yǎng)成分都按指示劑葡萄糖的比例添加。

在基于氨基酸的動態(tài)補(bǔ)料實(shí)驗(yàn)中，補(bǔ)料策略是基于拉曼監(jiān)測的GLC和精氨酸濃度（ARG）調(diào)整三種料液的補(bǔ)加（Feed A和Feed B和單獨(dú)的葡萄糖原液）。目的是將ARG水平維持在2.5 mM的設(shè)定值，同時將葡萄糖限制在11 mM的低水平。

2.7PLS模型

圖1：PLS模型用于校準(zhǔn)（灰色圓圈）和驗(yàn)證點(diǎn)（紅色菱形）輸出的預(yù)測與測量的葡萄糖(A)和乳酸(B)濃度值的圖

 

為了研究拉曼模型的預(yù)測性能，研究人員采用了一個獨(dú)立的生物反應(yīng)器培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)作為驗(yàn)證運(yùn)行。圖1A和B顯示了離線測量的葡萄糖和乳酸濃度與拉曼預(yù)測濃度，其中灰色圓圈為校準(zhǔn)，紅色菱形為驗(yàn)證樣品。兩種拉曼模型都能準(zhǔn)確估計(jì)葡萄糖和乳酸的低RMSEP值分別為1.64和4.51 mM，高r2值分別為0.986和0.998，效果較為理想。

圖2：在PLS回歸過程中，拉曼預(yù)測和離線測量數(shù)據(jù)之間的相關(guān)性：丙氨酸(A)、精氨酸(B)、苯丙氨酸(C)和纈氨酸(D)。校準(zhǔn)數(shù)據(jù)集用灰色圓圈表示，測試數(shù)據(jù)集用紅色菱形表示

 

表2：20種氨基酸成分構(gòu)建的偏最小二乘模型的性能(用于校準(zhǔn)、交叉驗(yàn)證和預(yù)測)

研究人員建立了ALA、ARG、ASP、ILE、LEU、PHE、GLU、THR、VAL和LYS的最佳模型，其中平均RMSEC和RMSECV誤差值分別為用于校準(zhǔn)的濃度范圍平均值的8 ± 1%和10 ± 1%。這些PLS模型的一些預(yù)測能力的例子如圖2A-D所示�？梢钥吹�，數(shù)據(jù)點(diǎn)（灰色圓圈）圍繞著理想的1：1線，這意味著模型提供的拉曼預(yù)測接近參考濃度測量值。

 

3結(jié)果
 

葡萄糖的動態(tài)補(bǔ)料：基于拉曼監(jiān)測GLC水平自動控制多組分補(bǔ)料培養(yǎng)基（補(bǔ)料A和補(bǔ)料B）

 

拉曼的過程控制在培養(yǎng)第4天（第93小時）前不久開始。此后，通過連續(xù)添加補(bǔ)料A（補(bǔ)料B培養(yǎng)基為補(bǔ)料A體積的1/10），將GLC保持在所需的低水平（11 mM），持續(xù)4天。在整個生物反應(yīng)器運(yùn)行過程中，為細(xì)胞總共補(bǔ)加了大約240 mL的補(bǔ)料A和24 mL的補(bǔ)料B。然而，由于使用多組分補(bǔ)料培養(yǎng)基將GLC調(diào)整到所需的水平，所有其他組分都根據(jù)兩種培養(yǎng)基的化學(xué)計(jì)量組成按葡萄糖比例供應(yīng)。這種方法的主要缺點(diǎn)是可能會過度補(bǔ)料其他營養(yǎng)物質(zhì)。

基于氨基酸的動態(tài)補(bǔ)料培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)：ARG(A)和GLC (B)的拉曼在線監(jiān)測和營養(yǎng)物質(zhì)補(bǔ)料的自動控制。多組分補(bǔ)料培養(yǎng)基（補(bǔ)料A和補(bǔ)料B）的添加，同時提供濃縮葡萄糖原液以避免葡萄糖耗盡。

 

其目標(biāo)是將葡萄糖和額外的關(guān)鍵營養(yǎng)物質(zhì)保持在一個可接受的濃度范圍內(nèi)，從而確保細(xì)胞處于一個平衡的培養(yǎng)環(huán)境。ARG和GLC的設(shè)定點(diǎn)分別為2.5mM和11 mM。此外，研究人員還設(shè)定了一個葡萄糖的上限（15 mM），以避免過量，因?yàn)檠a(bǔ)料A培養(yǎng)基中含有500 mM的葡萄糖。

 

在實(shí)驗(yàn)后期，觀察到ARG模型預(yù)測的誤差略有增加（圖4A）。因此，ARG保持在低于期望的2.5 mM的較低水平，這表明未來需要進(jìn)一步的模型優(yōu)化。相比之下，GLC在目標(biāo)點(diǎn)11 mM左右（在9到13mM之間）發(fā)生變化（圖4B）。比較提供的多組分飼料培養(yǎng)基的累積體積，在氨基酸動態(tài)補(bǔ)料實(shí)驗(yàn)中，分別補(bǔ)加了100 mL Feed A和10 mL Feed B，不到葡萄糖動態(tài)補(bǔ)料實(shí)驗(yàn)的一半。此外，當(dāng)所提供的補(bǔ)料A培養(yǎng)基不能將GLC水平提高到11 mM時，向反應(yīng)器中添加單獨(dú)的葡萄糖原液（2220 mM）。在整個培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，添加37 mL葡萄糖原液和100 mL補(bǔ)料A培養(yǎng)基后，總共需要132 mmol葡萄糖來維持所需的GLC水平。因此，側(cè)面證明了當(dāng)使用基于葡萄糖的補(bǔ)料策略調(diào)整添加培養(yǎng)基時，部分營養(yǎng)物質(zhì)存在過量添加的情況。

 

4結(jié)論

兩種動態(tài)補(bǔ)料培養(yǎng)的細(xì)胞密度(A)、活力(B)和產(chǎn)物滴度(C)

 

基于拉曼技術(shù)開發(fā)的兩種控制策略，很好地完成了對目標(biāo)參數(shù)的監(jiān)控和閉環(huán)補(bǔ)料控制。其中，采用基于葡萄糖的動態(tài)飼養(yǎng)策略，可以將葡萄糖濃度限制在一個恒定的低水平，但補(bǔ)料培養(yǎng)基中的其他營養(yǎng)物質(zhì)含量在培養(yǎng)結(jié)束時會過量并積累。相比之下，新開發(fā)的精氨酸補(bǔ)料策略可以有效地將氨基酸和葡萄糖的濃度控制在一個狹窄的范圍內(nèi)，從而為細(xì)胞建立一個更穩(wěn)定的生長環(huán)境。比較兩種補(bǔ)料策略對培養(yǎng)性能的影響，兩種策略在細(xì)胞密度、活力和產(chǎn)生的抗體濃度方面的結(jié)果相似。但是，與基于葡萄糖的動態(tài)補(bǔ)料策略相比，基于精氨酸的動態(tài)補(bǔ)料策略可以顯著減少（一半以上）添加的累積量，減少了培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基的使用量，提高了生產(chǎn)效率。

Domján, J., Pantea, E., Gyürkés, M., Madarász, L., Kozák, D., Farkas, A., Horváth, B., Benkő, Z., Nagy, Z.K., Marosi, G. & Hirsch, E. 2022, "Real‐time amino acid and glucose monitoring system for the automatic control of nutrient feeding in CHO cell culture using Raman spectroscopy", Biotechnology journal, vol. 17, no. 5, pp. e2100395-n/a.