敲除 RASA2助力提高過繼性 T 細(xì)胞持抗原敏感性和持久性

過繼性 T 細(xì)胞治療 (Adoptive T-cell therapy) 是指從患者或健康的捐贈(zèng)者體內(nèi)獲取 T 細(xì)胞，在體外培養(yǎng)改造后，使其靶向殺傷功能增強(qiáng)，然后重新回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，從而消滅腫瘤細(xì)胞^[1]。這是臨床研究中迅速發(fā)展的一種免疫治療方法，起效快，且體內(nèi)因素影響相對(duì)較小。目前有三種主要的過繼性 T 細(xì)胞療法 (圖 1)：腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞 (TIL) 療法、T 細(xì)胞受體工程化 T 細(xì)胞 (TCR-T) 療法和嵌合抗原受體 T 細(xì)胞 (CAR-T) 療法。

圖 1. 過繼性 T 細(xì)胞療法^[1]

a. TIL 療法：切除腫瘤后，分離腫瘤反應(yīng)性 T 細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)；b-c.TCR-T 與 CAR-T療法：通過病毒載體對(duì)外周血 T 細(xì)胞進(jìn)行基因修飾以表達(dá)特定的 TCR 或 CAR。在過繼轉(zhuǎn)移 TILs、TCR-T 或 CAR-T 細(xì)胞之前，患者先進(jìn)行淋巴細(xì)胞衰竭預(yù)治療，以創(chuàng)造過繼細(xì)胞可生存的空間和內(nèi)穩(wěn)態(tài)環(huán)境。

 

目前，臨床試驗(yàn)使用經(jīng)過改造的 CAR 和 TCR 在復(fù)發(fā)或難治性血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者中已產(chǎn)生了不錯(cuò)的治療效果^[2]，但過繼 T 細(xì)胞療法依然有很大的改善空間。研究表明，過繼 T 細(xì)胞治療癌癥的療效可能受到來自外部因素和內(nèi)在抑制檢查點(diǎn)的抑制信號(hào)的限制^[3]，而靶向基因編輯有可能克服這些限制并增強(qiáng) T 細(xì)胞治療功能。

 

今年 8 月 Nature 發(fā)表了一篇題為 RASA2 ablation in T cells boosts antigen sensitivity and long-term function 的文章——該研究證明了敲除 T 細(xì)胞中的 RASA2 可以提高其抗原敏感性和持久性^[4]。RASA2 是一種 RAS GTPase 激活蛋白 (RasGAP)，是人類T細(xì)胞中的信號(hào)檢查點(diǎn)，這項(xiàng)研究的發(fā)現(xiàn)意味著 RASA2 作為一個(gè)有希望的靶標(biāo)基因?qū)��?nbsp;T 細(xì)胞治療血液病和實(shí)體瘤適應(yīng)癥提供新的策略。下面我們就來看一下研究人員是如何開展這項(xiàng)研究的。

 

圖 2. RASA2 ablation in T cells boosts antigen sensitivity and long-term function 文章思維導(dǎo)圖

抑制性腫瘤微環(huán)境和 T 細(xì)胞內(nèi)在檢查點(diǎn)都會(huì)影響靶向?qū)嶓w瘤的工程 T 細(xì)胞的功效。為了識(shí)別 T 細(xì)胞中對(duì)內(nèi)在和外在抑制條件具有抗性的調(diào)節(jié)因子，研究人員利用全基因組 CRISPR 敲除來篩選原代人 T 細(xì)胞 (圖 3a)。他們使用來自多個(gè)獨(dú)立供體的 T 細(xì)胞和在多種抑制條件下進(jìn)行了分析，并在每一種分析條件下都用流式細(xì)胞技術(shù)分選鑒定了促進(jìn) T 細(xì)胞增殖的基因靶點(diǎn)。最后在高度分裂的 T 細(xì)胞中成功篩選出兩個(gè)候選抗性靶基因：TMEM222 和 RASA2 (圖 3b)�；�于該團(tuán)隊(duì)前期的研究^[5]，研究人員選擇進(jìn)一步對(duì) RASA2 敲除 (RASA2 Knock-out, RASA2-KO) 在過繼 T 細(xì)胞治療的作用進(jìn)行了研究。

 

圖 3. CRISPR 篩選確定 RASA2 為免疫抑制抵抗的調(diào)節(jié)劑^[4] 

a. 人類 T 細(xì)胞中抗藥基因靶點(diǎn)的全基因組篩選示意圖；b. 與非分裂細(xì)胞相比，高分裂細(xì)胞在所有篩選中共有的基因命中分析集中在兩個(gè)候選抗性目標(biāo)基因，TMEM222 和 RASA2

 

根據(jù)前人的研究預(yù)測(cè)，RASA2 可減弱 RAS 信號(hào)。RAS 信號(hào)是 T 細(xì)胞中控制細(xì)胞激活、增殖和分化的多條通路的主要交集 (圖 4a)。研究人員發(fā)現(xiàn)，白血病細(xì)胞系 Jurkat 細(xì)胞在TCR 刺激下，敲除 RASA2 會(huì)導(dǎo)致 RAS-GTP 水平升高，這與它作為 RAS 的 GTPase 激活蛋白的已知功能一致。在 RASA2 敲除的原代 T 細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)，MAPK 信號(hào)通路下游蛋白 pMEK、pERK、pS6 (圖 4b) 以及多種效應(yīng)細(xì)胞因子 IFNγ、IL-2、TNF 水平升高 (圖 4c)。值得注意的是，在沒有 TCR 刺激的情況下，對(duì)照細(xì)胞和 RASA2 敲除的 T 細(xì)胞活力穩(wěn)步下降，T 細(xì)胞 MAPK 信號(hào)、增殖和活化都取決于 TCR 的刺激。并且在 RASA2 缺陷型 T 細(xì)胞中還能檢測(cè)到更高水平的多種效應(yīng)細(xì)胞因子。這些結(jié)果表明，在 TCR 刺激的 T 細(xì)胞中，RASA2 敲除增強(qiáng)了關(guān)鍵信號(hào)通路的級(jí)聯(lián)，促進(jìn)了更強(qiáng)大的效應(yīng)功能；在沒有 TCR 刺激的情況下，RASA2 敲除不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞因子依賴性的喪失或不受控的增殖。  

圖 4. RASA2 敲除可以促進(jìn) T 細(xì)胞活化、提高抗原敏感性^[4]

  ■ 提高 T 細(xì)胞對(duì)抗原的敏感性

 

■ 增強(qiáng) T 細(xì)胞對(duì)癌細(xì)胞的殺傷力

  為了測(cè)試 RASA2 的敲除是否會(huì)改善慢性抗原暴露誘導(dǎo)的 T 細(xì)胞功能障礙，研究者們建立了一種重復(fù)刺激試驗(yàn)——將抗原特異性 T 細(xì)胞與新鮮靶腫瘤細(xì)胞以 1:1 的效靶比 (E:T) 進(jìn)行共培養(yǎng)，每 48 小時(shí)重復(fù)一次 (圖 6a)。在重復(fù)刺激下，抗原特異性 T 細(xì)胞相對(duì)富集 (CD39 比例逐漸升高)，T 細(xì)胞活力和活化水平下降 (圖 6b)，代謝譜的改變以及關(guān)鍵細(xì)胞表型標(biāo)記物的漸進(jìn)性變化，與功能失調(diào)的T細(xì)胞狀態(tài)一致。T 細(xì)胞暴露次數(shù)越多，控制癌細(xì)胞擴(kuò)張的能力越弱 (圖 6c)。 而 RASA2 敲除能夠緩解 T 細(xì)胞的活力下降。與對(duì)照組 T 細(xì)胞相比，重復(fù)刺激后 RASA2 敲除 T 細(xì)胞會(huì)表現(xiàn)出更高水平磷酸化 MAPK 信號(hào)、激活和多重效應(yīng)細(xì)胞因子 (圖 6d)；實(shí)時(shí)細(xì)胞代謝分析顯示，重復(fù)刺激后，與對(duì)照組T細(xì)胞相比，RASA2 敲除 T 細(xì)胞的基礎(chǔ)耗氧率 (OCR) 高于對(duì)照組 T 細(xì)胞的基礎(chǔ)耗氧率 (圖 6e)。接下來研究人員測(cè)試反復(fù)接觸腫瘤抗原是否會(huì)影響 RASA2 敲除 T 細(xì)胞的癌細(xì)胞殺傷能力。結(jié)果表明，與對(duì)照組 T 細(xì)胞相比， RASA2 敲除的 T 細(xì)胞在多次刺激后對(duì)癌細(xì)胞殺傷作用的優(yōu)勢(shì)更為顯著，RASA2 的敲除可使 TCR-T 細(xì)胞和 CAR-T 細(xì)胞對(duì)這種功能失調(diào)狀態(tài)產(chǎn)生抵抗力 (圖 6f-g)。    

 

圖 6. 通過反復(fù)接觸癌細(xì)胞，RASA2 敲除可以改善功能性 T 細(xì)胞的持久性^[4]

a. T 細(xì)胞重復(fù)刺激實(shí)驗(yàn)示意圖；b. 隨刺激次數(shù)增加，T 細(xì)胞活力下降；c. 在第 1、3、5 次對(duì) T 細(xì)胞刺激后，癌細(xì)胞生長(zhǎng)隨時(shí)間逐漸失控；d. RASA2-KO T 細(xì)胞的細(xì)胞因子 IL-2、IFNγ、TNF 水平升高；e. RASA2-KO T 細(xì)胞的 OCR 高于對(duì)照組T細(xì)胞的基礎(chǔ)耗氧率；f-g. 在第一次和最后一次次刺激 RASA-KO T 細(xì)胞仍能有效抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)，對(duì)照細(xì)胞在最后一次刺激時(shí)無法控制癌細(xì)胞

 

 

■ 改善 T 細(xì)胞在動(dòng)物模型的抗腫瘤效力

最后，研究人員在多個(gè)臨床前模型中測(cè)試了 RASA2 的敲除是否會(huì)改善過繼性T細(xì)胞治療的性能。通過 TCR-T 細(xì)胞治療的黑色素細(xì)胞瘤 A375 模型、TCR-T 細(xì)胞治療的白血病 Nalm6 模型、CAR-T 細(xì)胞治療的 Nalm6 模型以及 CAR-T 細(xì)胞治療的腹膜內(nèi)局部骨肉瘤 LM7 模型，證明了 RASA2 敲除可以提高腫瘤小鼠的存活率、延長(zhǎng)腫瘤小鼠的存活時(shí)間。以上結(jié)果說明 RASA2 敲除可以改善 TCR-T 和 CAR-T 細(xì)胞對(duì)抗一系列液體和固體腫瘤的臨床前模型的性能，突出了其在多種免疫治療適應(yīng)癥方面的潛力。研究人員也評(píng)估了過繼 T 細(xì)胞轉(zhuǎn)移對(duì)小鼠健康的影響，與對(duì)照組相比，RASA2 敲除的T細(xì)胞小鼠的體重和組織病理并沒有發(fā)生改變。敲除 CAR-T 細(xì)胞中的 RASA2 可以提高抗腫瘤療效 (圖7) 和生存率，且沒有明顯增加安全風(fēng)險(xiǎn)。

圖 7. RASA2-KO 的 CAR-T 細(xì)胞比對(duì)照 T 細(xì)胞的在第 56 天抑瘤效果比較 (藍(lán)圈中為腫瘤)^[4]

RASA2 是一種 RAS GTPase 激活蛋白 (RasGAP)，它是人類 T 細(xì)胞中新的信號(hào)檢查點(diǎn)。這項(xiàng)研究通過體外實(shí)驗(yàn)與多種臨床前模型強(qiáng)調(diào)了 RASA2 是一個(gè)有潛力的靶點(diǎn)，敲除該基因可以增強(qiáng) T 細(xì)胞治療癌癥的持久性和效力。在多個(gè)腫瘤小鼠模型上，RASA2 敲除 T 細(xì)胞更大限度地延長(zhǎng)了小鼠的壽命。

相關(guān)產(chǎn)品

Theralizumab 是一種超級(jí)激動(dòng)劑抗 CD28 單克隆抗體，可直接刺激 T 細(xì)胞。

Binetrakin是一種 T 淋巴細(xì)胞衍生的多效性細(xì)胞因子，可影響多種細(xì)胞類型，包括 B 細(xì)胞和 T 細(xì)胞。

Tacrolimus 可抑制 T 淋巴細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和 IL-2 轉(zhuǎn)錄。具有強(qiáng)免疫抑制特性。

Maydispenoid A 是一種免疫抑制劑，可抑制抗 CD3 /抗 CD28 單抗和脂多糖激活的小鼠脾細(xì)胞增殖。

Reltecimod 是一種 T 細(xì)胞特異性表面糖蛋白 CD28 (TP44) 拮抗劑，通過靶向和減弱關(guān)鍵的 CD28/B7-2 共刺激通路來調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。

Tyrosinase (192-200), human mouse 是一種多肽，可被 HLA-B44 分子上的細(xì)胞溶解 T 細(xì)胞 (CTL) 識(shí)別�？捎糜诤谏�素瘤相關(guān)癌癥的研究。

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參考文獻(xiàn)

1. Leon E, Ranganathan R, Savoldo B. Adoptive T cell therapy: Boosting the immune system to fight cancer. Semin Immunol. 2020 Jun;49:101437. 
2. Fesnak AD, June CH, Levine BL. Engineered T cells: the promise and challenges of cancer immunotherapy. Nat Rev Cancer. 2016;16(9):566-581. 
3. Anderson KG, et al. Obstacles Posed by the Tumor Microenvironment to T cell Activity: A Case for Synergistic Therapies. Cancer Cell. 2017 Mar 13;31(3):311-325. 
4. Carnevale J, Shifrut E, et al. RASA2 ablation in T cells boosts antigen sensitivity and long-term function. Nature. 2022 Sep;609(7925):174-182. 
5. Shifrut E, et al. Genome-wide CRISPR Screens in Primary Human T Cells Reveal Key Regulators of Immune Function. Cell. 2018 Dec 13;175(7):1958-1971.e15.