機(jī)械加載和炎癥調(diào)節(jié)人PDL成纖維細(xì)胞中的自噬信號(hào)通路

正畸牙齒移動(dòng)作為一種矯正錯(cuò)位牙齒的治療手段，如果不使牙周組織的結(jié)構(gòu)成分（包括牙齦、牙周韌帶 （PDL）、牙骨質(zhì)和牙槽骨）暴露在各種類型的壓力下，就無法誘導(dǎo)。由于其作為牙齒和骨骼之間連接的核心元素的位置和功能，PDL，特別是其主要的細(xì)胞類型，PDL成纖維細(xì)胞，在適應(yīng)壓力方面起著關(guān)鍵作用。

正畸牙齒移動(dòng)是通過對(duì)牙周膜施加機(jī)械應(yīng)力引起的，這導(dǎo)致細(xì)胞和組織的局部生物力學(xué)應(yīng)變，隨后是無菌炎癥，涉及炎性細(xì)胞因子的釋放，主要是白細(xì)胞介素-1（IL-1β）。少量 IL-1β已被證明有益于牙周重塑，包括傷口愈合，而 IL-1β 過量生成已被證明在牙周疾病病因中起作用。

研究表明，自噬是PDL成纖維細(xì)胞壓力調(diào)節(jié)的關(guān)鍵過程。此外，炎癥細(xì)胞因子IL-1β 也以劑量依賴性方式調(diào)節(jié)自噬相關(guān)基因，表明自噬在牙周炎癥中起重要作用。自噬受到多種信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。其中最關(guān)鍵的是哺乳動(dòng)物雷帕霉素（mTOR）信號(hào)通路靶點(diǎn)，該信號(hào)通路抑制自噬。上游的磷脂酰肌醇3-激酶/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Akt（PI3K/AKT）是mTOR的重要調(diào)節(jié)通路。在下游，mTOR與真核細(xì)胞翻譯啟始因子4E結(jié)合蛋白1（4E-BP1）和70-kDa核糖體蛋白S6激酶（P70S6K）相互作用，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成。

因此，德國(guó)波恩大學(xué)正畸系、雷根斯堡大學(xué)醫(yī)學(xué)中心正畸科、美因茨大學(xué)約翰內(nèi)斯·古騰堡大學(xué)醫(yī)學(xué)中心的一項(xiàng)聯(lián)合研究探討了不同程度的機(jī)械壓力和炎癥刺激是如何影響PDL成纖維細(xì)胞的自噬活性的，此外還分析mTOR通路是否受到不同程度的壓力或炎癥刺激的影響。
 

機(jī)械壓力和炎癥刺激對(duì)自噬的影響

首先，在機(jī)械和炎癥刺激 PDL成纖維細(xì)胞4、16或24小時(shí)后，分析測(cè)量自噬體的積累（圖1 a-c）。

結(jié)果表明，機(jī)械壓力為 4、6 和 8 g/cm2持續(xù)4小時(shí)導(dǎo)致熒光強(qiáng)度顯著增加近2倍，而2 g/cm2的壓力沒有顯著改變熒光強(qiáng)度。壓力加載16小時(shí)后，與對(duì)照細(xì)胞相比，所有測(cè)試壓力水平均顯著增加熒光強(qiáng)度。8 g/cm2組的熒光強(qiáng)度增加了3倍以上。然而，24小時(shí)后，施加8 g/cm2的最大壓力不再增強(qiáng)熒光強(qiáng)度；2、4和6 g/cm2的較低壓力量級(jí)仍顯示熒光強(qiáng)度顯著增加（圖1 b）。

有趣的是，用 0.1 ng/mL IL-1β進(jìn)行炎癥刺激4 h可使熒光強(qiáng)度顯著降低 25% 以上，而濃度為1 ng/mL則沒有任何顯著影響。然而，濃度為10 ng/mL IL-1β的濃度在同一時(shí)間范圍內(nèi)使熒光強(qiáng)度增加了25%以上。當(dāng)PDL成纖維細(xì)胞在炎癥條件下培養(yǎng)16和24小時(shí)時(shí)，所有評(píng)估的IL-1β濃度均顯著提高熒光強(qiáng)度（圖1 c）。

圖1(a） 對(duì)于 FACS 分析，定義并設(shè)置了決定性細(xì)胞群，如左圖所示。在y軸上，顯示了最大熒光事件的百分比（右圖）。（b）熒光顯示，在2、4、6或8 g/cm2或無壓力處理4、16或24 h后，自噬體積累的影響。自噬通量通過氯喹處理中斷。（c）用0.1、1.0或10 ng/mL IL-1β處理4、16或24小時(shí)或不處理后，熒光顯示對(duì)自噬體積累的影響。自噬通量通過氯喹處理中斷。

 

機(jī)械壓力和炎癥刺激對(duì)mTOR信號(hào)通路的影響

總體而言，由于機(jī)械壓力或炎癥刺激，磷酸化蛋白的比例比非磷酸化蛋白的比例更大。2 g/cm2 的壓力刺激（代表正畸牙齒移動(dòng)期間的生理?xiàng)l件）比應(yīng)激條件下（即超負(fù)荷和炎癥）引起的比率變化要小。

AKT磷酸化的平衡在生理負(fù)荷條件下轉(zhuǎn)向降低磷酸化。壓力過載增加了磷酸化位點(diǎn)Ser124上的AKT1磷酸化比例，但對(duì)磷酸化位點(diǎn)Tyr474上的AKT1磷酸化有不利影響。炎癥使磷酸化位點(diǎn) AB-124 和 AB-450 上的 AKT1 磷酸化比例升高。然而，與對(duì)照組相比，磷酸化和非磷酸化蛋白AKT的倍數(shù)變化顯示出總體下調(diào)。與對(duì)照組相比，mTOR蛋白的變化也低于0.75倍。

上游，非磷酸化和磷酸化的PI3K的平衡在壓力過載或炎癥刺激后轉(zhuǎn)向磷酸化。在下游，在不同的結(jié)合位點(diǎn)評(píng)估多種蛋白質(zhì)，如4E-BP1和P70S6K。壓力為 2 g/cm2 導(dǎo)致磷酸化位點(diǎn)Thr45上的4E-BP1磷酸化水平降低，而IL-1β增加了4E-BP1的比例。磷酸化位點(diǎn)Ser418上的P70S6K磷酸化的倍數(shù)變化在所有治療組中均增加了1.6倍以上。

 

機(jī)械壓力和炎癥刺激對(duì)膠原蛋白1 基因表達(dá)的調(diào)控

mTOR的激活控制蛋白質(zhì)合成。因此，在刺激24小時(shí)后評(píng)估膠原蛋白1的基因表達(dá)，膠原蛋白1是PDL成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)的最重要成分。雷帕霉素處理后抑制mTOR顯著降低膠原1基因表達(dá)。此外，各種程度的機(jī)械壓力顯著降低了膠原蛋白1的基因表達(dá)，在4 和 6 g/cm2 的壓力組中，降低了 75% 以上。中等濃度 IL-1β 的炎癥刺激也導(dǎo)致膠原蛋白1的基因表達(dá)降低 50% 以上。然而，低濃度和高濃度的 IL-1β 處理對(duì)膠原1基因表達(dá)沒有顯著影響（圖2 a）。
 

 

圖2（a）2、4、6、8 g/cm2的壓力或0.1、1.0、10 ng/mL 濃度的IL-1β對(duì)24 h后I型膠原蛋白基因表達(dá)的影響。未處理的細(xì)胞作為對(duì)照。雷帕霉素處理抑制mTORC1作為陰性對(duì)照。（b）2、4、6、8 g/cm2的壓力或0.1、1.0、10 ng/mL 濃度的IL-1β對(duì)24 h后對(duì)Ki67基因表達(dá)的影響。未處理的細(xì)胞作為對(duì)照。雷帕霉素處理抑制mTORC1作為陰性對(duì)照。

 

機(jī)械壓力和炎癥刺激對(duì)增殖標(biāo)記物Ki67基因表達(dá)的影響

細(xì)胞命運(yùn)通路mTOR調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖。因此，在機(jī)械壓力和炎癥刺激后，分析了細(xì)胞增殖特異性標(biāo)志物 Ki67的基因表達(dá)。雷帕霉素對(duì)mTORC1的抑制導(dǎo)致Ki67基因表達(dá)減少。生理壓力為 2 g/cm2對(duì)Ki67基因表達(dá)有不良影響，并誘導(dǎo)Ki67表達(dá)上調(diào)近 50%。更高的壓力幅度為 4 和 6 g/cm2時(shí)下調(diào)Ki67的基因表達(dá)。有趣的是，壓力為 8 g/cm2 對(duì)2Ki67基因表達(dá)無顯著影響（圖2 b）。低濃度IL-1β處理沒有改變 Ki67 基因表達(dá)，而較高濃度的1和10 ng/mL IL-1β處理使Ki67基因表達(dá)顯著降低了40% 以上（圖2 b）。

 

機(jī)械壓力和炎癥刺激對(duì)細(xì)胞死亡的影響

細(xì)胞死亡由mTOR通路決定，與自噬密切相關(guān)。通過FACS分析鑒定碘化丙啶（PI）陽(yáng)性細(xì)胞。

有趣的是，應(yīng)用2 g/cm2 的壓力持續(xù)24小時(shí)可顯著降低20% 以上的細(xì)胞死亡，因此其具有細(xì)胞保護(hù)作用。16小時(shí)后，相同的壓力顯著增加PI陽(yáng)性細(xì)胞。用 2g/cm2壓力處理24小時(shí)，與對(duì)照組相比，并沒有顯著改變PI陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量。加壓4小時(shí)后，僅8 g/cm2的高幅度壓力能顯著誘導(dǎo)細(xì)胞死亡 20% 以上，而4和6 g/cm2的壓力對(duì)死亡細(xì)胞數(shù)量無顯著影響。然而，在用4、6和8 g/cm2的壓力持續(xù)16和24小時(shí)后，死亡細(xì)胞數(shù)量顯著增加2倍以上（圖3 a）。

炎癥刺激4小時(shí)沒有改變細(xì)胞死亡率。與對(duì)照相比，在炎癥條件下培養(yǎng)16小時(shí)導(dǎo)致死亡細(xì)胞數(shù)量增加 25% 以上。有趣的是，24小時(shí)后，低濃度和高濃度IL-1β提高了細(xì)胞死亡數(shù)，而與對(duì)照組相比，中等濃度的IL-1β減少了死亡細(xì)胞的數(shù)量（圖3 b）。

圖3   （a）用2，4，6或8 g/cm2的壓力持續(xù)4，16或24小時(shí)或無壓力無氯喹處理后，熒光顯示對(duì)細(xì)胞死亡的影響。（b）用0.1、1.0或10 ng/mL IL-1β處理4、16或24小時(shí)或無氯喹處理后，熒光表示對(duì)細(xì)胞死亡的影響。

 

綜上所述，該研究結(jié)果為PDL成纖維細(xì)胞在機(jī)械壓力和炎癥刺激后的自噬活動(dòng)提供了新的見解。應(yīng)激刺激的自噬反應(yīng)是劑量和時(shí)間依賴性的。一般來說，自噬是由應(yīng)激刺激誘導(dǎo)的，而短暫應(yīng)用低壓或低IL-1β濃度不會(huì)影響或減少自噬。此外，mTOR通路還受到生理壓力、過載和炎癥刺激的影響。研究結(jié)果還表明，mTOR信號(hào)通路對(duì)機(jī)械壓力和炎癥應(yīng)激后自噬活性的影響。通過蛋白質(zhì)合成、增殖和細(xì)胞死亡分析，機(jī)械壓力和炎癥刺激的影響也可以通過細(xì)胞命運(yùn)的變化檢測(cè)到。細(xì)胞死亡受到機(jī)械壓力和炎癥刺激的調(diào)節(jié)。有趣的是，生理壓力為 2 g/cm2 時(shí)甚至可以發(fā)揮保護(hù)作用，而過載會(huì)增加死亡細(xì)胞的數(shù)量。關(guān)于炎癥刺激誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，治療持續(xù)時(shí)間似乎比IL-1β濃度更重要。

 

參考文獻(xiàn)：Blawat K, Mayr A, Hardt M, Kirschneck C, Nokhbehsaim M, Behl C, Deschner J, Jäger A, Memmert S. Regulation of Autophagic Signaling by Mechanical Loading and Inflammation in Human PDL Fibroblasts. Int J Mol Sci. 2020 Dec 11;21(24):9446. doi: 10.3390/ijms21249446. PMID: 33322510; PMCID: PMC7763506.

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33322510/

 

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