中藥材黃曲霉素檢測(cè)技術(shù)操作詳解

一、 中藥材質(zhì)量安全現(xiàn)狀
 
中藥材是中醫(yī)防病治病的重要基礎(chǔ)。中藥材在田間生長(zhǎng)、采收加工、儲(chǔ)藏運(yùn)輸?shù)雀鱾�(gè)環(huán)節(jié)都會(huì)因污染霉菌而發(fā)生霉變。這些霉菌分泌的有毒代謝產(chǎn)物使中藥材發(fā)霉變質(zhì)，直接威脅到群眾的用藥安全。中藥中的霉菌毒素主要有黃曲霉毒素，赭曲霉素，玉米赤霉烯酮，展青毒素，伏馬毒素等。中藥材的種類是影響真菌毒素污染的主要因素,易污染的中藥材,在不同的溫、濕度條件下均可產(chǎn)生真菌毒素。溫度和濕度條件也可以影響真菌毒素的增長(zhǎng),如：黃曲霉毒素在不同的溫、濕度條件下均可以產(chǎn)生；赭曲霉毒素需要在濕度較高的條件下才能產(chǎn)生。
 
近年來(lái),隨著中藥材在國(guó)際市場(chǎng)上的持續(xù)升溫,其安全性越來(lái)越引起人們的關(guān)注。真菌毒素殘留作為中藥材微量外源性有毒有害物質(zhì),一般不表現(xiàn)出急性毒性,但通常有較強(qiáng)的蓄積性,致癌、致畸、致突變作用明顯,嚴(yán)重影響中藥材的安全性。
 
二、 中藥材真菌毒素控制相關(guān)國(guó)家法規(guī)
 
近年來(lái)，各級(jí)食品藥品監(jiān)管部門不斷加大中藥監(jiān)管力度，努力保持中藥質(zhì)量總體穩(wěn)定。
 
國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局關(guān)于規(guī)范中藥生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)秩序嚴(yán)厲查處違法違規(guī)行為的通知（國(guó)食藥監(jiān)安[2012]187號(hào)文件）中，要求加強(qiáng)對(duì)黃曲霉毒素、重金屬及有害元素、農(nóng)藥殘留量等安全性指標(biāo)的檢測(cè)和控制，切實(shí)保證中藥材質(zhì)量和安全，另要求企業(yè)具備與生產(chǎn)品種相適應(yīng)的檢驗(yàn)設(shè)備和能力，嚴(yán)把質(zhì)量檢驗(yàn)關(guān)。
 
《國(guó)家藥品安全“十二五”規(guī)劃》，規(guī)劃中明確指出“開(kāi)展藥品快速檢驗(yàn)技術(shù)研究，搭建檢驗(yàn)技術(shù)共享平臺(tái)”、“加快推進(jìn)藥品快速檢驗(yàn)技術(shù)在基層的應(yīng)用，配置快速檢驗(yàn)設(shè)備”，“加強(qiáng)縣級(jí)機(jī)構(gòu)快速檢驗(yàn)?zāi)芰�建設(shè)”的要求。
 
三、 中藥材真菌毒素檢測(cè)項(xiàng)目及限量標(biāo)準(zhǔn)
 
國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局對(duì)柏子仁、蓮子、使君子、檳榔、麥芽、肉豆蔻、決明子、遠(yuǎn)志、薏苡仁、大棗、地龍、蜈蚣、水蛭、全蝎等14味藥材及其飲片品種項(xiàng)下增加“黃曲霉毒素”檢查項(xiàng)目，限度為“黃曲霉毒素B1不得過(guò)5 μg/kg；黃曲霉毒素G2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素B2總量不得過(guò)10 μg/kg”。
 
2010 版《藥典》附錄IX V 黃曲霉毒素測(cè)定采用高效液相色譜法，另外增補(bǔ)藥典描述該法檢測(cè)建立增加柱后光化學(xué)衍生法。
 
四、 中藥材黃曲霉素檢測(cè)方案介紹
（一）   儀器分析法
特點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn)	缺點(diǎn)
準(zhǔn)確、靈敏、抗干擾性強(qiáng)，國(guó)家檢測(cè)部門的確證方法。	儀器成本高、對(duì)操作人員技術(shù)要求高、操作復(fù)雜、耗時(shí)較長(zhǎng)。

免疫親和柱-高效液相色譜法：符合2010版《藥典》附錄IX V中黃曲霉毒素測(cè)定高效液相色譜法，另外增補(bǔ)藥典描述該法檢測(cè)建立增加柱后光化學(xué)衍生法。
1.   設(shè)備和耗材配置　　

序號(hào)	品名	規(guī)格及參數(shù)	數(shù)量	用途
1	高效液相色譜儀		一臺(tái)	分析檢測(cè)
2	熒光檢測(cè)器		一臺(tái)	讀取熒光信號(hào)
3	真菌毒素專用色譜柱	150/250mm 貨號(hào)：PRC-18	一支	配套各類色譜儀，霉菌毒素檢測(cè)用
4	GuanyiBio®黃曲霉毒素總量免疫親和柱	3ml，25支/盒，快速過(guò)柱型， 貨號(hào)：IAC-011-3	若干	高特異性，純化樣本
5	GuanyiBio®KRC光化學(xué)柱后衍生反應(yīng)裝置	貨號(hào)：EQ-KRC	一臺(tái)	適用于黃曲霉毒素檢測(cè)
6	高速均質(zhì)器	達(dá)到22000rpm 以上，貨號(hào)：EQ-WR-1L	一臺(tái)	耐腐蝕，高速，均質(zhì)
7	GuanyiBiot®玻璃纖維濾紙	100P,110mm，1.5μm 貨號(hào)：GMF-110	一盒	霉菌毒素專用過(guò)濾
8	GuanyiBio®八位泵流操作架	貨號(hào)：EQ-PUMP-8	一臺(tái)	用于控制免疫親和柱過(guò)柱流速
9	黃曲霉毒素混標(biāo)	2µg/ml黃曲霉毒素B1, G1;0.5µg/ml黃曲霉毒素B2;G2 (4/1/4/1)溶于乙腈, 貨號(hào)：STD#1081	1ml	用于定量分析標(biāo)準(zhǔn)品的配制

2. 樣品前處理:冠一為中藥材提供不同的處理方案(詳細(xì)方案請(qǐng)聯(lián)系冠一，冠一開(kāi)發(fā)了針對(duì)多種中藥材基質(zhì)提供優(yōu)化的處理方案)
3. 免疫親和柱凈化:
富集--洗滌--洗脫--收集全部洗脫液供化學(xué)衍生檢測(cè)用。
4. 化學(xué)衍生
為什么使用光化學(xué)衍生器？ 由于黃曲霉具有較強(qiáng)的紫外吸收和產(chǎn)生熒光的特性，因此可以進(jìn)行HPLC-紫外或熒光檢測(cè)，但是同時(shí)黃曲霉毒素中的B1、G1 由于其在含水的流動(dòng)相中容易產(chǎn)生熒光淬滅，因此在很多的實(shí)驗(yàn)中都會(huì)采用衍生法測(cè)定黃曲霉毒素。衍生的方法也很多：有柱前的，柱后的，在線的，由于在線的柱后光化學(xué)衍生有明顯的優(yōu)勢(shì)，所以現(xiàn)在被增補(bǔ)為藥典的檢測(cè)方法，優(yōu)勢(shì)主要在于無(wú)需任何化學(xué)試劑、對(duì)人員無(wú)傷害；無(wú)需人員直接操作、避免誤差; 無(wú)需擔(dān)心衍生液腐蝕檢測(cè)器。
5. 高效液相色譜分析
 

冠一 KRC光化學(xué)衍生器  波長(zhǎng)：254 nm HPLC-色譜柱 ：黃曲霉毒素專用C-18色譜柱   150 x 4.6 mm; 流  動(dòng)  相 ：甲醇-水  45:55 流  速  ： 1.0 mL/min                          柱  溫  ： 35 °C 進(jìn) 樣 體 積 ： 20μL 熒光檢測(cè)器：λ-激發(fā)波長(zhǎng)：365nm λ-發(fā)射波長(zhǎng)：455 nm HPLC配置；高效液相色譜儀帶有熒光檢測(cè)器；黃曲霉毒素專用色譜柱 C18 150 x 4.6 mm

（二）酶聯(lián)免疫法
特點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn)	缺點(diǎn)
靈敏度高、耗時(shí)較短、樣本處理比較簡(jiǎn)單、對(duì)技術(shù)人員要求不高、檢測(cè)成本低、可同時(shí)檢測(cè)大批量樣本。適用于大量樣本快速定量篩查。	可能存在一定假陽(yáng)性率（交叉反應(yīng)率）。

冠一推出的GuanyiBiot^R黃曲霉毒素總量試劑盒具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確度，適用于大量樣本的定量分析。
1. 方法原理
采用直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法，在微孔板上預(yù)包被黃曲霉毒素抗原，加入樣本（或黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液）及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的黃曲霉毒素特異抗體。樣本或標(biāo)準(zhǔn)品溶液中的抗原與預(yù)包被在板孔上的抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合酶標(biāo)抗體。未結(jié)合的酶標(biāo)抗體在洗滌時(shí)被除去。再加入TMB顯色液，讀取吸光值。樣品吸光值與其所含黃曲霉毒素總量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣品中黃曲霉毒素總量的含量。
2. 設(shè)備和試劑配置：

序號(hào)	品名	規(guī)格及參數(shù)	數(shù)量	用途
1	GuanyiBioR黃曲霉毒素總量試劑盒	96T，靈敏度：0.1ppb 貨號(hào)：EKT-011	一盒	定量分析檢測(cè)
2	GuanyiBio離心小柱	25T	一盒	凈化樣本
3	酶標(biāo)儀（酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀）	濾光片：450nm	一臺(tái)	配套各類色譜儀，霉菌毒素檢測(cè)用

3. 樣本前處理：中藥材：粉碎、提取、離心，取上清液加入GuanyiBio離心小柱進(jìn)行凈化。
為什么要用GuanyiBio離心小柱？中藥材的基質(zhì)復(fù)雜，提取時(shí)樣本液顏色較深，而且不容易去除。有機(jī)試劑提取凈化方法繁瑣，試劑揮發(fā)對(duì)環(huán)境及人體造成危害，且凈化效果不穩(wěn)定。用GuanyiBio離心小柱，則只需提取液離心過(guò)柱，即可去除提取液中的雜質(zhì)，方便快捷，凈化效果好，且回收率可以達(dá)到85%以上。
4. 檢測(cè)步驟
4.1 免疫反應(yīng)30min；洗板5次；顯色反應(yīng)30min；終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀讀OD值。
5. 分析結(jié)果的表述
用酶標(biāo)儀判讀結(jié)果。
 
（三）免疫金標(biāo)快速檢測(cè)法
特點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn)	缺點(diǎn)
操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用低廉、耗時(shí)短、檢測(cè)快速。適用于樣本快速定性初步篩查	存在一定假陽(yáng)性、數(shù)據(jù)不方便保存及分析。

冠一推出的GuanyiBio^TM黃曲霉毒素總量免疫金標(biāo)快速檢測(cè)條特異性好，適用于檢測(cè)樣本量大；短時(shí)間出具檢測(cè)結(jié)果并控制經(jīng)費(fèi)的情況，可以快速定性，初篩。
1. 方法原理
黃曲霉毒素總量快速檢測(cè)條應(yīng)用了競(jìng)爭(zhēng)抑制免疫層析的原理，樣本中的黃曲霉毒素總量在酶標(biāo)孔中與膠體金標(biāo)記的特異性抗黃曲霉毒素單克隆抗體結(jié)合，抑制了抗體和NC膜檢測(cè)線上AF－BSA偶聯(lián)物的結(jié)合。如果樣本中黃曲霉素總含量大于0.5 ug/L，檢測(cè)線不顯顏色，結(jié)果為陽(yáng)性；反之，檢測(cè)線顯紅色，結(jié)果為陰性。
2.   設(shè)備和試劑配置

序號(hào)	品名	規(guī)格及參數(shù)	數(shù)量	用途
1	GuanyiBioTM黃曲霉毒素總量免疫金標(biāo)快速檢測(cè)條	25T 檢測(cè)限：10ppb 貨號(hào)：PR-011	一盒	定性分析檢測(cè)

3.   分析步驟：中藥材粉碎溶解后取上清液檢測(cè)。吸取樣品滴加到加樣孔中，8-15分鐘讀取結(jié)果。在C線顯色的情況下：T 線顯色比C線深或一樣深是陰性。T 線顯色比C線淺，或無(wú)顯色是陽(yáng)性結(jié)果。
 
五、 溫馨TIPS：
1. 中藥中真菌生長(zhǎng)繁殖的有利條件主要是適宜的溫度與水分。如能將中藥貯存于10℃以下，水分保持在10％以下，就能有效地防霉。
2. 從事真菌毒素科研及檢測(cè)的人員，必須注意防護(hù)，如穿戴隔離衣帽，在進(jìn)行真菌分離培養(yǎng)工作時(shí)，應(yīng)戴口罩，并盡量防止孢子飛揚(yáng)。
3. 操作臺(tái)面如有漏濺，應(yīng)立即用新配的5％次氯酸鈉消毒。以5％次氯酸鈉（NaOCl）處理時(shí)，黃曲霉毒素于數(shù)秒鐘內(nèi)即被破壞，故是常用的消毒劑。
4. 也有應(yīng)用生物學(xué)方法解毒的報(bào)道，生物學(xué)方法成本低，收效大，可能是一種有前途的除毒措施。
鑒于霉菌毒素對(duì)人體的危害，提醒各位奮斗在抗毒一線的老師們一定要注意保護(hù)自身安全哦！