腫瘤免疫治療的下一個(gè)"頂流"之NK細(xì)胞的介紹與相關(guān)免疫治療的研究

瀏覽次數(shù)：7729　發(fā)布日期：2023-1-29　來(lái)源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

隨著新冠疫情防控政策的放開，越來(lái)越多人中招進(jìn)入“羊圈”。有專家根據(jù)數(shù)學(xué)模型測(cè)算，我國(guó)最終可能有80%至90%的人會(huì)感染新冠病毒。這是一場(chǎng)不可避免的戰(zhàn)爭(zhēng)。

免疫力是人體自身的防御機(jī)制，是戰(zhàn)勝病毒的終極武器。免疫力的強(qiáng)弱與機(jī)體的免疫細(xì)胞息息相關(guān)。而NK細(xì)胞是固有免疫細(xì)胞家族中的重要成員，常年奮戰(zhàn)在人體抵抗癌細(xì)胞和病毒感染的第一道防線上，是守衛(wèi)人體健康的生力軍。有科學(xué)研究表明：自然殺傷細(xì)胞（natural killer cells ，NK細(xì)胞）數(shù)量充足且活性更好的患者，病毒載量下降更快，癥狀或更輕！

本文將圍繞NK細(xì)胞的發(fā)育和分類、NK細(xì)胞的激活和抑制信號(hào)、腫瘤微環(huán)境中的NK細(xì)胞、NK細(xì)胞相關(guān)免疫治療等方面展開，帶大家認(rèn)識(shí)一下NK細(xì)胞~

1 NK細(xì)胞的發(fā)育和分類
目前主流的NK細(xì)胞發(fā)育模型認(rèn)為，NK細(xì)胞來(lái)源于骨髓中的CD34⁺CD45RA⁺造血祖細(xì)胞(HPCs)。在骨髓中，NK細(xì)胞由HPCs通過(guò)常見的淋巴樣祖細(xì)胞(CLPs)和NK細(xì)胞前體(NKPs)發(fā)展而來(lái)，然后遷移到外周血(Conventional NK cells, cNK細(xì)胞)或組織(tissue-resident NK cells, trNK細(xì)胞)。

trNK細(xì)胞的分化發(fā)生在不同的組織部位，包括肺、胸腺、肝臟、子宮、皮膚、皮下脂肪組織和腎臟。在這些位點(diǎn)，NK細(xì)胞具有不同的表型特征和功能，構(gòu)成了NK細(xì)胞在不同成熟階段的循環(huán)。除了不同的組織類型外，即使在同一器官和同一組織中，NK細(xì)胞也具有高度的異質(zhì)性。

圖1. NK細(xì)胞的發(fā)育和亞群^[1]

NK細(xì)胞通常根據(jù)表面蛋白CD56和CD16的相對(duì)表達(dá)分為兩類：CD56^brightCD16^-(免疫調(diào)節(jié)，細(xì)胞因子產(chǎn)生)和CD56^dimCD16⁺(細(xì)胞毒性)。其中，CD56^dimCD16^bright占全部NK細(xì)胞的90%，CD56^brightCD16^neg/dim只占約10%。

CD56^bright NK細(xì)胞是強(qiáng)大的細(xì)胞因子生產(chǎn)者，除非被IL-15等促炎細(xì)胞因子啟動(dòng)，否則具有弱細(xì)胞毒性。相比之下，CD56^dimNK細(xì)胞群可以介導(dǎo)感染和/或惡性細(xì)胞的系列殺傷，主要是通過(guò)含有顆粒酶B和穿孔素的預(yù)先組裝的細(xì)胞溶解顆粒的胞吐作用，最終誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡。

圖2. NK細(xì)胞的表型及功能^[2]

2 NK細(xì)胞的激活和抑制信號(hào)
NK細(xì)胞作為固有免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞類型，能夠在早期殺傷腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞。它們依靠“迷失自己”（missing-self）和“誘導(dǎo)自己”（induced-self）模式來(lái)識(shí)別靶細(xì)胞，在激活信號(hào)和抑制信號(hào)之間保持精確的平衡。這些相互作用的信號(hào)最終決定了NK細(xì)胞的激活和功能狀態(tài)。

NK細(xì)胞激活信號(hào)包括細(xì)胞因子結(jié)合受體、整合素、殺傷受體(CD16、NKp40、NKp30和NKp44)、識(shí)別非自身抗原的受體(Ly49H)和其他受體(如NKp80、SLAMs、CD18、CD2和TLR3/9)�？偟膩�(lái)說(shuō)，根據(jù)配體的不同，NK細(xì)胞的激活受體至少可以分為三種類型，包括MHC-I特異性受體、MHC-I相關(guān)受體和MHC-I非相關(guān)受體。

NK細(xì)胞抑制信號(hào)主要包括識(shí)別MHC-I的受體，如Ly49s、NKG2A和LLT1，以及一些MHC-I非相關(guān)受體。此外，MHC-I特異性抑制受體根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能一般可分為三種類型：殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(KIRs)、殺傷凝集素樣受體(KLRs)和白細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(LILRs)。

圖3. NK細(xì)胞功能受細(xì)胞表面受體和細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)^[3]

3 腫瘤微環(huán)境中的NK細(xì)胞
腫瘤微環(huán)境（tumour microenvironmentm, TEM）高度復(fù)雜且不斷發(fā)展，其可維持腫瘤生長(zhǎng)并影響免疫逃逸和惡性腫瘤進(jìn)展，除了基質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞外，TME還包括固有免疫細(xì)胞和適應(yīng)性免疫細(xì)胞。

NK細(xì)胞常見于人類腫瘤的TME，包括原發(fā)腫瘤、轉(zhuǎn)移灶和腫瘤浸潤(rùn)淋巴結(jié)。當(dāng)NK細(xì)胞被整合素、趨化因子受體和選擇素招募時(shí)，它們從血液中滲出，穿過(guò)ECM和腫瘤間質(zhì)，到達(dá)腫瘤床。在TME中，NK細(xì)胞通過(guò)脫顆粒、ADCC或 FASL/TRAIL誘導(dǎo)的凋亡消除腫瘤。此外，NK細(xì)胞還可以分泌細(xì)胞因子或趨化因子來(lái)招募其他免疫細(xì)胞，并上調(diào)其抗腫瘤反應(yīng)。NK細(xì)胞的反應(yīng)性往往受到腫瘤細(xì)胞或其他細(xì)胞分泌的抑制因子或細(xì)胞與細(xì)胞直接相互作用的阻礙。

臨床統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，TME中NK細(xì)胞的豐度預(yù)示著幾種癌癥患者的預(yù)后更好，包括肝細(xì)胞癌(HCC)、黑色素瘤、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)、鱗狀細(xì)胞肺癌、肺腺癌、腎細(xì)胞癌、胃癌。這種浸潤(rùn)不僅增強(qiáng)了對(duì)靶細(xì)胞的直接殺傷，而且還提供了免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，從而形成適應(yīng)性免疫反應(yīng)。

圖4. 腫瘤微環(huán)境中的NK細(xì)胞^[4]

4 NK細(xì)胞相關(guān)免疫治療
NK細(xì)胞能夠識(shí)別并與腫瘤細(xì)胞反應(yīng)，是一種重要的抗腫瘤免疫療法效應(yīng)器。
近年來(lái)，NK細(xì)胞相關(guān)免疫治療的研究蓬勃發(fā)展，最新的進(jìn)展主要集中在細(xì)胞因子療法、過(guò)繼性NK細(xì)胞療法、基因工程化NK細(xì)胞療法、單克隆抗體和NK細(xì)胞銜接器等方面。此外，基于NK細(xì)胞的治療無(wú)論是單獨(dú)使用還是與其他治療方法聯(lián)合使用都取得了良好的效果，這表明它在惡性腫瘤中具有廣泛而有效的應(yīng)用前景。

圖5. 基于NK細(xì)胞的治療策略^[5]

1) 細(xì)胞因子療法
據(jù)報(bào)道，IL-2可以直接刺激T細(xì)胞和NK細(xì)胞的增殖和激活。因此，IL-2經(jīng)常被用于在體外激活NK細(xì)胞，然而它在體內(nèi)的使用受到毒副作用和激活免疫抑制性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的限制。為優(yōu)化IL-2作為免疫治療劑的療效，研究人員對(duì)IL-2進(jìn)行了修飾或工程化處理以誘導(dǎo)NK細(xì)胞的更大激活和擴(kuò)張，同時(shí)減少Treg細(xì)胞的擴(kuò)張。

IL-15是有望替代IL-2功能的細(xì)胞因子之一，它可以刺激NK和CD8+T細(xì)胞，但是不會(huì)激活Treg細(xì)胞。目前，多款I(lǐng)L-15重組蛋白正在臨床試驗(yàn)中接受檢驗(yàn)。此外，其他可用于激活NK細(xì)胞的細(xì)胞因子有IL-12、IL-18、IL-21，以及TGFβ抑制劑。

2) 過(guò)繼性NK細(xì)胞治療
大多數(shù)以NK為基礎(chǔ)的過(guò)繼轉(zhuǎn)移治療從各種來(lái)源獲取NK細(xì)胞，通過(guò)各種方法增強(qiáng)其體外功能，然后將其注入癌癥患者體內(nèi)。自體和同種異體NK細(xì)胞都可以作為過(guò)繼性NK細(xì)胞療法的來(lái)源。

目前，同種異體的NK細(xì)胞來(lái)源多種多樣，包括外周血NK細(xì)胞、來(lái)自臍帶血或胎盤的NK細(xì)胞，以及從誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）分化生成的NK細(xì)胞。有些研究顯示，臍帶血來(lái)源的NK細(xì)胞更容易培養(yǎng)并且激活，不過(guò)從成人外周血中獲得的NK細(xì)胞更具有天然的細(xì)胞裂解能力。NK細(xì)胞系（比如NK92）和iPSC細(xì)胞系可能提供可以重復(fù)再生的NK細(xì)胞來(lái)源。

3) 基因工程化NK細(xì)胞療法
通過(guò)嵌合抗原受體(CARs)對(duì)免疫細(xì)胞進(jìn)行基因修飾，直接靶向腫瘤細(xì)胞是一種很有前途的癌癥治療方法。在NK細(xì)胞表面表達(dá)靶向腫瘤抗原的CAR可以賦予NK細(xì)胞靶向特定腫瘤的能力。

與CAR-T相比，CAR-NK治療的優(yōu)勢(shì)很明顯，包括識(shí)別腫瘤的可能性更高（包括細(xì)胞因子和凋亡），細(xì)胞因子釋放風(fēng)暴（cytokine releasing storm , CRS）的發(fā)生率更低。而且即使CAR-NK細(xì)胞失去了CAR，仍然可以通過(guò)內(nèi)在表達(dá)的激活性受體識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞。

4) 單克隆抗體
根據(jù)抗體的靶向不同，可以分為兩類：
一類是靶向腫瘤相關(guān)抗原的治療性抗體，例如靶向表皮生長(zhǎng)因子受體（Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR）的西妥昔單抗（Cetuximab）、靶向CD20的利妥昔單抗（Rituximab），通過(guò)NK細(xì)胞誘導(dǎo)ADCC效應(yīng)達(dá)到治療目的；另一類是直接靶向NK細(xì)胞抑制受體的抗體，例如靶向NKG2A的莫那利珠單抗（Monalizumab），活化NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷。

5) NK細(xì)胞銜接器
各種免疫逃避機(jī)制限制了NK細(xì)胞在體內(nèi)與腫瘤細(xì)胞的結(jié)合程度，是實(shí)現(xiàn)廣泛有效的NK細(xì)胞治療的主要障礙。為了增強(qiáng)腫瘤浸潤(rùn)性NK細(xì)胞的自然細(xì)胞毒性，許多研究團(tuán)隊(duì)已經(jīng)在開發(fā)一些分子，使這些細(xì)胞以抗原特異性的方式與腫瘤細(xì)胞接觸。這些分子通常是由多個(gè)抗體（通常為單鏈抗體）組成的雙特異或三特異性接合器，可以同時(shí)靶向腫瘤細(xì)胞抗原以及NK細(xì)胞活化受體，將NK細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞“拉攏”在一起，進(jìn)而引發(fā)NK細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞。

5 NK細(xì)胞研究相關(guān)小鼠模型
基于現(xiàn)有研究，南模生物自主研發(fā)了一系列NK細(xì)胞相關(guān)工具鼠，如Cre工具鼠，熒光報(bào)告工具鼠和DTR工具鼠等。Cre工具鼠跟特定的flox小鼠交配，可實(shí)現(xiàn)在NK細(xì)胞中敲除或者敲入目的基因，完成對(duì)基因在NK細(xì)胞中的功能研究；熒光報(bào)告工具鼠是通過(guò)在小鼠marker基因處敲入報(bào)告基因構(gòu)建而成，可以達(dá)到在體內(nèi)標(biāo)記NK細(xì)胞的目的；DTR工具鼠則是在小鼠marker基因位點(diǎn)敲入DTR（diphtheria toxin receptor，白喉毒素受體），可以用于研究巨噬細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中的作用；NVG-hIL15小鼠模型是對(duì)M-NSG小鼠Il15基因進(jìn)行人源化修飾構(gòu)建而成，在進(jìn)行免疫系統(tǒng)重建時(shí)，可以得到更高比例的NK細(xì)胞，用于CAR-NK細(xì)胞治療等方面的藥效研究。

此外，南模生物還可提供NK細(xì)胞相關(guān)靶點(diǎn)人源化的小鼠模型，為NK相關(guān)藥物的藥效評(píng)估和安全性評(píng)價(jià)提供了強(qiáng)有力的工具。具體信息見下表：

驗(yàn)證數(shù)據(jù):
· Ncr1-2A-Cre(NM-KI-190027)

圖6. 流式檢測(cè)Ncr1-(2A-iCre)^+/-; Rosa26 tdTomato^+/- 小鼠外周血和脾臟的NK細(xì)胞中tdtomato的表達(dá)。

圖7. Ncr1^icre/+; Rosa26^tdTomato/+ 雙轉(zhuǎn)基因鼠，可在皮膚、腎臟、頜下唾液腺(SMG)和腦的部分細(xì)胞中表達(dá)tdTomato。

圖8. Ncr1^icre/+; Rosa26^tdTomato/+ 小鼠各組織中tdTomato的表達(dá)情況。

· Ncr1-IRES-DTRGFP(NM-KI-190044)

圖9.Ncr1-IRES-DTRGFP 雜合子MC38荷瘤小鼠和野生型MC38荷瘤小鼠不同時(shí)間點(diǎn)腫瘤生長(zhǎng)情況。（數(shù)據(jù)是與CrownBio 合作完成）

圖10. Ncr1-IRES-DTRGFP雜合子MC38荷瘤小鼠和野生型MC38荷瘤小鼠不同時(shí)間點(diǎn)外周血中NK 細(xì)胞含量。（數(shù)據(jù)是與CrownBio 合作完成）

圖11. Ncr1-IRES-DTRGFP雜合子MC38荷瘤小鼠和野生型MC38荷瘤小鼠不同時(shí)間點(diǎn)外周血中NK 細(xì)胞含量。（數(shù)據(jù)是與CrownBio 合作完成）

· NVG-hIL15(GM-NVG-210001)

圖12. 人PBMC在NVG-hIL15中的移植效率和在體內(nèi)對(duì)K562-luc細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制。

圖13. 外周血來(lái)源NK細(xì)胞在NVG-hIL15小鼠中的增殖和細(xì)胞毒性。

圖14. CAR-NK92細(xì)胞在NVG-hIL15小鼠體內(nèi)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷毒性。

南模生物深耕基因編輯領(lǐng)域，提供全方位模式生物服務(wù)，包括基因修飾成品模型供應(yīng)、個(gè)性化模型定制、飼養(yǎng)繁育、表型分析、藥效評(píng)價(jià)等，滿足不同實(shí)驗(yàn)室需求。
Reference:

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