實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)操作流程

實(shí)時(shí)熒光定量 PCR，簡(jiǎn)稱 RT-QPCR, 屬于 Q-PCR 的一種，目前該技術(shù)已得到廣泛應(yīng)用，如：擴(kuò)增特異性分析、基因定量分析、基因分型、SNP 分析等。熒光定量 PCR 最常用的方法是 DNA 結(jié)合染料 SYBR GreenⅠ的非特異性方法和Taqman 水解探針的特異性方法。
 
SYBR Green I 是一種結(jié)合于所有 dsDNA 雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長(zhǎng)的熒光染料，可與所有的各種序列的雙鏈 DNA 分子結(jié)合。在游離狀態(tài)下，SYBR Green I 發(fā)出微弱的熒光，但一旦與雙鏈 DNA 結(jié)合，嵌入至 dsDNA，熒光大大增強(qiáng)。
因此，SYBR Green I 的熒光信號(hào)強(qiáng)度與雙鏈 DNA 的數(shù)量相關(guān)，PCR 擴(kuò)增不同時(shí)期中，dsDNA 含量不同，SYBR Green I 熒光信號(hào)強(qiáng)度不同�？梢愿鶕�(jù)熒光信號(hào)檢測(cè)出 PCR 體系存在的雙鏈 DNA 數(shù)量，并可根據(jù)對(duì)照進(jìn)行相關(guān)的計(jì)算和分析。

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
實(shí)驗(yàn)開始前，需準(zhǔn)備好實(shí)驗(yàn)所需的各種試劑和耗材。
試劑包括：特異性 PCR 引物，新鮮提取備用的總 RNA。
使用的試劑盒有：用于合成 cDNA 第一鏈的羅氏試劑盒 Transcriptor FirstStrand cDNA Synthesis Kit，包含了 cDNA 反應(yīng)所需要的所有實(shí)驗(yàn)組分以及相關(guān)的正對(duì)照反應(yīng)組分。配套 LightCycler® 480 使用的試劑盒 LightCycler® 480 SYBR Green I Master，包含了 PCR 所需的各種實(shí)驗(yàn)組分，如 1 號(hào)管中包含熱啟動(dòng) Taq DNA Polymerase及反應(yīng)緩沖液，dNTP mix，SYBR Green I 染料和 MgCl2
正式試驗(yàn)開始前，冰上解凍各個(gè)試劑及試劑盒組分，置于冰上待用。注意：SYBR Green I Master 需避光放置。
所需儀器與耗材有： LightCycler® 480 全自動(dòng)實(shí)時(shí)定量 PCR 儀以及配套使用的 96 或 384 多孔板，透明封板膜等一次性耗材。朗基T30 PCR 儀、rainin單道移液器、Nunc 冰盒及NEST 盒裝吸頭等。
 
實(shí)驗(yàn)操作流程：
1.用新鮮提取的 RNA 反轉(zhuǎn) 錄合成 cDNA 第一鏈，然后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量 PCR，其中包括：SYBR Green 反 應(yīng)體系的配置；PCR 程序設(shè)置；運(yùn)行 PCR 實(shí)驗(yàn)，樣品編輯和結(jié)果分析。

2.反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) :
反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA 第一鏈實(shí)驗(yàn)操作時(shí)注意：所有 RNA 相關(guān)的操作均要佩戴手套，防止 RNase 污染。
相關(guān)操作嚴(yán)格按照試劑盒使用說明進(jìn)行相關(guān)操作。
按照體系配方在冰上的 Rnase free 的滅菌 PCR 管中配置 Template primer mix，總體系 13μl，本實(shí)驗(yàn)是聯(lián)合使用 anchored oligo dT 引物和隨機(jī)六聚體引物進(jìn)行的反轉(zhuǎn)錄。先配置 NTC 對(duì)照，加入 9 號(hào)管水 10μl、 6 號(hào)管的 50mM oligo dT 引物 1μl、5 號(hào)管的 0.6mM 隨機(jī)六聚體引物 2μl，混勻。然后進(jìn)行樣品一號(hào)管的體系配置，依次加入 1μl 已調(diào)整濃度的總 RNA、1μl oligo dT 引物、2μl 隨機(jī)六聚體
引物、最后加 9μl 水補(bǔ)充至總體積 13μl，混勻。其他樣品管，參照 1 號(hào)管的配置方法，依次加好反應(yīng)體系。
注意：可將總RNA的模板量適當(dāng)調(diào)整至 10ng-5μg，mRNA調(diào)整至 1-100ng。若 RNA 樣品濃度較低，則可加入 10μg/ml 的 MS2 RNA 來穩(wěn)定模板 RNA。將配好的反應(yīng) mix 在 PCR 儀中 65℃變10min，可有效減少 RNA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)。加熱后迅速置于冰上驟冷，放置 5min。在反應(yīng) Template primer mix 中按體系配方順序，依次加入以下試劑：2 號(hào)管的 5×反轉(zhuǎn)錄酶 buffer，4 號(hào)管 dNTP mix，3 號(hào)管 40 U/μl 的 RNase 抑制劑，1 號(hào)管 20 U/μl 的反轉(zhuǎn)錄酶，最終體積為 20μl。若樣品數(shù)較多，先配置反應(yīng) mix 再分裝，小心吸打混合，切勿渦旋振蕩�；靹蚝笥谒矔r(shí)離心機(jī)上短暫離心，使樣品和反應(yīng)液落至離心管底部。
將離心管放置 PCR 中，根據(jù)使用的引物以及目標(biāo) mRNA 的片段長(zhǎng)度進(jìn)行程序設(shè)置。本實(shí)驗(yàn)反應(yīng)溫度和時(shí)間設(shè)置為：25℃，10min，55℃反應(yīng) 30min。反應(yīng)完畢后，于 85℃下加熱 5min 滅活反轉(zhuǎn)錄酶，再置于冰上停止反應(yīng)。
此反應(yīng)產(chǎn)物可于 2-8℃存放 1-2h，或在-15 至-25℃下存放更長(zhǎng)時(shí)間。

3. Q-PCR 擴(kuò)增
cDNA 產(chǎn)物無需進(jìn)行純化即可用于后續(xù)的 PCR 反應(yīng)。20μl 的 PCR 反應(yīng)體系可取 2-5μl cDNA 反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增。此試劑盒中的反轉(zhuǎn)錄酶具有 RNase H 活性，可以在 cDNA 合成之后去除 RNA 模版，減少其對(duì)后續(xù) PCR 的影響。
本部分實(shí)驗(yàn)，我們選用 SYBR Green I Master 試劑盒進(jìn)行定量分析。本實(shí)驗(yàn)共設(shè)置 5 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品，包含 1 個(gè)標(biāo)記為 0 的空白對(duì)照，5 個(gè)反轉(zhuǎn)錄樣品，包含 NTC 對(duì)照，由于樣品數(shù)較多，先配制不含模版的總體系，再分裝為 10管，加入各個(gè)樣品的模板后，再將每個(gè)樣品分裝為 3 個(gè)復(fù)孔。
按照體系配方分別加入綠色蓋子的 2×Master Mix，10x Primer 上下游引物，PCR 級(jí)別水�？傮w系配好后，在用移液槍輕柔吸打均勻，然后分裝為 10 管，每管 55μl。往 10 管中分別加入各個(gè)樣品對(duì)應(yīng)的調(diào)整好濃度的 cDNA。
STD 零加入 6μl 水代替模板，其余 STD 分別加入 6μl 已經(jīng)逐級(jí)稀釋好的標(biāo)樣模板。反轉(zhuǎn)錄樣品分別加入 6μl 濃度調(diào)整好的模板 DNA，包含 NTC�；靹�，然后將每個(gè)樣按 20μl 每孔分裝至 96 孔板中。用封孔膜蓋好 96 孔板，將多孔板置于合適的離心機(jī)中 1500×g 配平離心 2min 將準(zhǔn)備好的 96 孔板放置在 LightCycler® 480 設(shè)備中。

4.程序設(shè)定
雙擊打開 LightCycler® 480 的 1.5 軟件并登陸，自動(dòng)進(jìn)入軟件界面，點(diǎn)擊 newexperiment,在Detection Format 選項(xiàng)中選擇 SYBR Green I 模式, 點(diǎn)擊 OK 完成檢測(cè)通道的設(shè)定,接下來設(shè)置反應(yīng)體積，對(duì)于 96 模塊，反應(yīng)體系為 10μl-100μl 之間，本實(shí)驗(yàn)是設(shè)定 20μl 的反應(yīng)體系。
在 Program Name 中輸入反應(yīng)名稱 pre incubation，預(yù)變性設(shè)定 1 個(gè)循環(huán)，無需進(jìn)行熒光的收集，執(zhí)行的溫度和時(shí)間設(shè)定為 95℃ 10min，視圖會(huì)根據(jù)設(shè)定進(jìn)行實(shí)時(shí)的調(diào)整。點(diǎn)擊增加按鈕，輸入 Amplification，定義擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)為 45 次，并選擇熒光的收集功能 Quantification，然后設(shè)定 PCR 擴(kuò)增循環(huán)的溫度與時(shí)間為 95℃ 10s，點(diǎn)擊增加按鈕，設(shè)定退火溫度和時(shí)間為 60℃ 10s，以上兩步 Acquisition Mode都默認(rèn)選擇 None，繼續(xù)點(diǎn)擊增加按鈕，設(shè)置延伸溫度和時(shí)間為 72℃ 20s，Acquisition Mode 選擇 Single，Ramp Rate 均按自動(dòng)調(diào)整值，無需再設(shè)置。
設(shè)置溶解曲線，在 Program 中的新的一行中輸入 Melting Curves，1 個(gè)循環(huán)數(shù)，Analysis Mode 選擇 Melting Curves，時(shí)間和溫度設(shè)置為 95℃ 5s，點(diǎn)擊增加按鈕，新增設(shè)置溫度和時(shí)間為 65℃ 1min，以上兩步 Acquisition Mode 都默認(rèn)選擇 None。點(diǎn)擊增加按鈕，新增設(shè)置溫度為 95℃，Acquisition Mode 選擇 Continuous,其他設(shè)置無需改動(dòng)。設(shè)置保溫的過程 Cooling，只需 1 個(gè)循環(huán)，無需收集熒光，設(shè)定溫度和時(shí)間為 40℃、1min。設(shè)置完成后點(diǎn)擊右邊的保存按鈕保存設(shè)置的程序。此時(shí)整個(gè) PCR
的循環(huán)體系、溫度的設(shè)置已經(jīng)設(shè)定完畢。
點(diǎn)擊 Start run 開始運(yùn)行 PCR 反應(yīng)，此時(shí)可在軟件上實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)樣品擴(kuò)增情況。

5.樣品編輯
實(shí)驗(yàn)結(jié)束，點(diǎn)擊 Sample Editor，進(jìn)入樣本編輯區(qū)。Select Workflow 中選擇 Abs Quant。根據(jù)樣本在板中排布的方式進(jìn)行樣本編輯。設(shè)置陰性對(duì)照、空白對(duì)照、標(biāo)準(zhǔn)品以及未知樣品等。
在 Select Sample 中，選中需要設(shè)置的樣品孔。在下一欄中的 Sample Name輸入被選擇樣品組的名稱，并在 Sample Type 中選擇樣品組的類型，最后點(diǎn)擊Make Replicates 設(shè)置復(fù)孔。標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)置時(shí)，需填寫拷貝數(shù)，只需填寫好稀釋倍數(shù)，初始濃度即可。編輯好樣品后，即可進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。如有需要，也可進(jìn)行子集編輯。

6.結(jié)果分析
樣品編輯好后，可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析。點(diǎn)擊左邊欄下方的 sum 按鈕，相應(yīng)出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)的所有信息，包括：設(shè)計(jì)的反應(yīng)程序，實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析等。點(diǎn)擊 analysis，可以根據(jù)樣品已有的數(shù)據(jù)進(jìn)行細(xì)致準(zhǔn)確地分析。點(diǎn)擊 Abs Quant second derivative max，彈出 create new analysis 窗口，在 Subset選項(xiàng)中選擇分析樣品的分布區(qū)域，點(diǎn)擊確定，即可出現(xiàn)分析圖：相應(yīng)樣品的擴(kuò)增曲線。
Standard Curve 是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品得出的標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線左側(cè)標(biāo)有擴(kuò)增效率、斜率、截距、線性關(guān)系、以及錯(cuò)誤率。一般“Error”值越小，說明實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確率越高。擴(kuò)增效率如果越接近“2”，說明這次的擴(kuò)增反應(yīng)越好。在數(shù)據(jù)表格，可顯示單個(gè)樣本的 Cp 值，以及相應(yīng)的樣本濃度值。按復(fù)孔進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，顯示 Cp 平均值，方差，濃度的平均值以及方差。

蘇州阿爾法生物提供的實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、高速離心機(jī)、恒溫混勻儀、rainin移液器等試驗(yàn)設(shè)備及1.5ml離心管、pcr管、酶標(biāo)板等實(shí)驗(yàn)耗材，廣泛用于熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。