代謝組學(xué)的應(yīng)用：抑郁癥存在性別差異腦膜淋巴管起關(guān)鍵作用

文章標(biāo)題：A functional role of meningeal lymphatics in sex difference of stress susceptibility in mice

發(fā)表期刊：Nature Communications

影響因子：17.694

發(fā)表時(shí)間：2022年8月

作者單位：中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院

百趣提供服務(wù)：發(fā)現(xiàn)代謝組學(xué)Standard-親脂版

百趣代謝組學(xué)分享—研究背景
代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，抑郁癥(Major Depressive Disorder, MDD)作為一種常見(jiàn)的精神疾病，其特征是持續(xù)的抑郁情緒以及動(dòng)力和興趣的喪失�，F(xiàn)如今，影響全球約4.4%的人口，是非致命健康損失的主要原因。

目前研究表明，女性比男性更容易患上抑郁癥，并伴隨著更嚴(yán)重的抑郁癥狀。代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，盡管在臨床報(bào)告中已有充分的證據(jù)證明抑郁癥存在著顯著的性別差異，但其潛在的機(jī)制很大程度上仍不清楚。

重復(fù)應(yīng)激是促進(jìn)抑郁癥發(fā)病的重要環(huán)境因素。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，反復(fù)的壓力同時(shí)也會(huì)引起免疫系統(tǒng)的顯著變化。代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，盡管這些發(fā)現(xiàn)表明異常免疫功能與抑郁癥之間有很強(qiáng)的聯(lián)系，但對(duì)于壓力如何改變免疫系統(tǒng)來(lái)調(diào)節(jié)抑郁癥的易感性，我們?nèi)匀恢�之甚少。代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，長(zhǎng)期以來(lái)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central Nervous System, CNS)一直被認(rèn)為是一種“免疫特權(quán)”器官，因?yàn)樗�缺乏淋巴管�?lái)運(yùn)輸免疫細(xì)胞。然而，最近的研究證實(shí)了人類(lèi)和其他動(dòng)物的硬腦膜中存在淋巴管。

這些腦膜淋巴管通過(guò)連接頸深淋巴結(jié)(deep Cervical Lymph Nodes, dCLNs)不斷將CNS的液體和分子引流到外周，并在免疫細(xì)胞的主動(dòng)運(yùn)輸中發(fā)揮重要作用。據(jù)報(bào)道，發(fā)生在衰老過(guò)程中腦膜淋巴管的改變，能夠促使神經(jīng)退行性和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的進(jìn)展，代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，包括阿爾茨海默氏病、帕金森病、創(chuàng)傷性腦損傷、腦炎和腦瘤。然而，應(yīng)激是否影響腦膜淋巴調(diào)節(jié)抑郁癥的發(fā)展仍有待進(jìn)一步研究。

百趣代謝組學(xué)分享—研究方法
在這項(xiàng)研究中，我們使用亞慢性變應(yīng)激(Sub-Chronic Variable Stress，SCVS)刺激小鼠，在6d內(nèi)將小鼠暴露于三種交替的應(yīng)激源中。代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，據(jù)報(bào)道，這種模式會(huì)誘導(dǎo)女性產(chǎn)生抑郁癥狀，但在男性中沒(méi)有。因此模式為本研究?jī)?nèi)容提供了一個(gè)合適的模型。

實(shí)驗(yàn)前每天處理動(dòng)物2~3min，連續(xù)處理3d。然后，它們?cè)?d內(nèi)交替受到三種不同的壓力源，以避免習(xí)慣化：第1d，小鼠接受100個(gè)（0.45mA，1s）的隨機(jī)間隔腳電擊，持續(xù)1h。第2d，小鼠接受尾懸掛壓力，持續(xù)1h。第3d，將每只小鼠置于家中籠子的穿孔約束管中，持續(xù)1h。代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，在接下來(lái)的3d里重復(fù)同樣的壓力源（圖1）。
 

圖1. SCVS處理和行為測(cè)試的實(shí)驗(yàn)時(shí)間表

百趣代謝組學(xué)分享—研究結(jié)果
1.亞慢性變應(yīng)激對(duì)雌性小鼠腦膜淋巴細(xì)胞有損害作用，但對(duì)雄性小鼠無(wú)影響

在SCVS處理后，雌雄小鼠均有顯著的體重減輕（圖2b，3b）。代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，另外，應(yīng)激雌性小鼠較少前往開(kāi)闊場(chǎng)地的中心區(qū)域（圖2f-i），表現(xiàn)出抑郁和焦慮樣行為。
 

圖2. 6d的SCVS誘導(dǎo)雌性小鼠的抑郁和焦慮樣行為

相比之下，應(yīng)激雄性小鼠在開(kāi)闊視野中心區(qū)域的行走距離顯著增加，顯示出抗焦慮表型（圖3f-i）。
 

圖3. 6d的SCVS誘導(dǎo)雄性小鼠的抑郁和焦慮樣行為

qPCR分析顯示，SCVS處理顯著降低雌性小鼠硬腦膜淋巴管內(nèi)皮受體-1(Lymphatic vessel endothelial Receptor-1, Lyve1)的mRNA水平，而SCVS處理下的雄性小鼠無(wú)顯著降低（圖4a-c）。
 

圖4. SCVS引起的硬腦膜Lyve1 mRNA表達(dá)變化的性別差異，以及幼稚雌性和雄性小鼠腦膜淋巴管的比較

為了進(jìn)一步驗(yàn)證SCVS處理對(duì)雌性小鼠腦膜淋巴的損傷，在最后一次行為測(cè)試72h后向小腦延髓池注入70kD葡聚糖示蹤劑，1h后恢復(fù)正常（圖5a-c）。
 

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)雌性小鼠出現(xiàn)腦膜淋巴管形態(tài)的損傷（圖6）。相比之下，雄性小鼠在SCVS處理后，腦膜淋巴系統(tǒng)雖然對(duì)應(yīng)激表現(xiàn)出一定的敏感性，但與非應(yīng)激成年雌性和雄性小鼠相比，腦膜淋巴管的整體形態(tài)以及腦內(nèi)注射示蹤劑到dCLNs的引流沒(méi)有顯著差異（圖4d-h）。
 

圖7. 腦內(nèi)注射AAV-VEGFC改善了雌性小鼠的腦膜淋巴管，減輕了應(yīng)激誘導(dǎo)的抑郁樣行為

在非應(yīng)激雌性小鼠中，腦內(nèi)注射AAV-VEGFC促進(jìn)了腦膜淋巴生長(zhǎng)，但不影響上述行為（圖8a-m）。代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，這表明腦膜淋巴管的增強(qiáng)本身并不足以改變雌性小鼠的抑郁或焦慮類(lèi)行為，相反，增強(qiáng)了它們對(duì)壓力的適應(yīng)能力。
 

圖8. AAV-VEGFC的池內(nèi)遞送改善了腦膜淋巴管，而不影響抑郁行為以及非應(yīng)激雌性小鼠mPFC中星形膠質(zhì)細(xì)胞蛋白的表達(dá)和VTA多巴胺能神經(jīng)元中c-FOS的表達(dá)

另外，與非應(yīng)激組相比，經(jīng)歷SCVS處理的雌性小鼠對(duì)社交活動(dòng)和蔗糖水的偏好顯著降低，而這兩種偏好都被子宮內(nèi)注射AAV-VEGFC所消除（圖9a-e）。
 

3.腦膜淋巴管的改善可使應(yīng)激引起的雌性小鼠的mPFC和VTA發(fā)生改變
為了觀察SCVS和VEGFC處理是否會(huì)影響腦脊液在腦實(shí)質(zhì)的流入和擴(kuò)散，將卵白蛋白(OVA)-Alexa Fluor 647示蹤劑注入雌鼠小腦延髓池，并于1h后灌流。代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，SCVS處理減少了在腦實(shí)質(zhì)、腦膜淋巴管附近和dcln中檢測(cè)到的示蹤劑（圖2j，p，q和圖10a-c），這表明SCVS處理增加了雌性小鼠腦室和蛛網(wǎng)膜下腔的示蹤劑積累。

由于SCVS處理后間質(zhì)流體(Interstitial Fluid, ISF)大分子的流動(dòng)減少（圖10l-q），我們推斷SCVS處理?yè)p傷腦膜淋巴管可能導(dǎo)致脂質(zhì)在腦實(shí)質(zhì)積聚，進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)(medial Prefrontal Cortex, mPFC)和中腦腹側(cè)被蓋區(qū)(Ventral Tegmental Area, VTA)異常，而VEGFC治療阻止了這些變化。
 

為此，對(duì)mPFC、VTA和硬腦膜進(jìn)行脂質(zhì)組學(xué)分析，比較三組雌性小鼠：(1)未注射AAV-eGFP的小鼠；(2)注射AAV-eGFP并經(jīng)歷SCVS處理的小鼠；(3)小鼠注射AAV-VEGFC和經(jīng)歷SCVS處理（圖11a）。代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，通過(guò)OPLS-DA評(píng)分圖發(fā)現(xiàn)三組分離明顯（圖11b）。SCVS處理后，包括長(zhǎng)鏈甘油三酯(triacylglycerols, TAG)在內(nèi)的多種脂質(zhì)在mPFC中顯著增加，而在SCVS處理后VTA中也有一小部分TAG的增加，這被VEGFC治療部分阻止了（圖11c，d）。代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，重要的是，VEGFC治療顯著增加了硬腦膜中包括長(zhǎng)鏈TAG在內(nèi)的一組脂質(zhì)分子（圖11e）。
 

圖11. 幼稚雄性小鼠腦內(nèi)注射AAV-VEGFR3d1-4或經(jīng)歷SCVS的雄性小鼠AAV-VEGFC不會(huì)改變抑郁和焦慮樣行為

4.腦膜淋巴管損傷使雄性小鼠易受應(yīng)激影響
VEGFR3d1-4-IgG Fc的過(guò)表達(dá)顯著降低硬腦膜上矢狀竇(Superior Sagittal Sinus, SSS)和橫竇(Transverse Sinus, TS)/竇匯(Confluence Of Sinuses, COS)中的Lyve1的表達(dá)，以及Lyve1標(biāo)記的腦膜淋巴管的直徑和覆蓋面積（圖12c-g）。同時(shí)，在硬腦膜和dcln中檢測(cè)到的腔內(nèi)注射示蹤劑的數(shù)量顯著減少（圖12c，h-j）。

重要的是，VEGFR3d1-4-IgG Fc過(guò)表達(dá)的雄性小鼠在濺水試驗(yàn)中梳洗時(shí)間顯著減少，在強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)中靜止時(shí)間顯著增加，并在SCVS處理后表現(xiàn)出社交障礙（圖12k，l和圖9f-I）。代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，VEGFR3d1-4或vegfr3d4-7過(guò)表達(dá)的雄性小鼠在抑制攝食試驗(yàn)中，在進(jìn)食潛伏期、體重變化、整體運(yùn)動(dòng)和開(kāi)放場(chǎng)地試驗(yàn)中對(duì)中心區(qū)域的探索方面均無(wú)顯著差異，在蔗糖偏好試驗(yàn)中也無(wú)顯著差異（圖12r和圖9f，j）。

值得注意的是，在沒(méi)有SCVS處理的情況下，VEGFR3d1-4單獨(dú)治療并不會(huì)影響非應(yīng)激雄性小鼠在抑郁行為測(cè)試中的表現(xiàn)（圖11a-d），這表明腦膜淋巴損傷本身不足以誘導(dǎo)雄性小鼠的抑郁行為，但會(huì)增加它們對(duì)應(yīng)激的敏感性。代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，此外，SCVS處理的雄性小鼠中，腦內(nèi)注射過(guò)表達(dá)VEGFC的AAV并不會(huì)影響動(dòng)物在抑郁和焦慮類(lèi)行為測(cè)試中的表現(xiàn)，也不會(huì)影響體重的變化（圖11i-q），這表明腦膜淋巴在調(diào)節(jié)抑郁和焦慮類(lèi)行為中的作用存在“天花板效應(yīng)”。
 

另外，SCVS處理并未顯著改變雄性小鼠mPFC中星形細(xì)胞蛋白的表達(dá)，也未改變VTA中TH+多巴胺能神經(jīng)元中c-FOS的表達(dá)。代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，然而，VEGFR3d1-4處理后的雄性小鼠在mPFC中S100β+和GFAP表達(dá)明顯減少，S100β+星形膠質(zhì)細(xì)胞密度降低，在VTA中TH+多巴胺能神經(jīng)元中c-FOS表達(dá)減少（圖13-j）。

綜上所述，腦膜淋巴管的損傷或通過(guò)腦膜淋巴管的引流增加了雄性小鼠對(duì)應(yīng)激的敏感性，并促進(jìn)了應(yīng)激引起的mPFC和VTA的異常。
 

百趣代謝組學(xué)分享—結(jié)論
研究發(fā)現(xiàn)SCVS處理對(duì)雌性小鼠腦膜淋巴細(xì)胞有損害作用，而對(duì)雄性小鼠無(wú)損害作用。代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，功能獲得與喪失的研究進(jìn)一步表明，腦膜淋巴管導(dǎo)致了小鼠對(duì)抑郁和焦慮行為應(yīng)激敏感性的性別差異。結(jié)果揭示了短期應(yīng)激對(duì)腦膜淋巴管形態(tài)和通過(guò)腦膜淋巴管的腦引流功能具有性別依賴(lài)性。另外，腦膜淋巴管的變化可以調(diào)節(jié)應(yīng)激敏感性。