流體剪切應(yīng)力通過膜聯(lián)蛋白A6介導(dǎo)的自噬調(diào)節(jié)MC3T3-E1細胞成骨分化

機械力學(xué)信號對骨量調(diào)節(jié)、骨穩(wěn)態(tài)和骨骼適應(yīng)有深遠影響。通常，機械力傳遞到骨組織，并由機械敏感細胞（骨細胞、成骨細胞、破骨細胞及其祖細胞）感知，通過細胞增殖、分化和凋亡導(dǎo)致成骨。許多體外研究證實，成骨細胞對各種不同的剪切應(yīng)力（FSS）都有敏感反應(yīng)，其中最常用的范圍為0.5-2Pa。迄今為止，F(xiàn)SS對骨重塑的影響已受到廣泛關(guān)注，但對其潛在的分子機制知之甚少，例如FSS如何與其他過程（包括自噬）整合，從而極大地促進骨重塑以刺激成骨細胞的分化。

膜聯(lián)蛋白A（AnxA）是一個鈣離子依賴的磷脂結(jié)合蛋白家族，參與細胞膜的組成、胞吞、胞吐、離子通道調(diào)節(jié)、離子通道活性、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及細胞膜與細胞骨架的連接等。研究表明，成骨細胞和平滑肌細胞中AnxA6的異常表達會導(dǎo)致一些病理過程，例如骨質(zhì)疏松癥和動脈粥樣硬化。此外，AnxA6通過調(diào)節(jié)囊泡脂膜的形成和促進細胞胞吐作用來促進自噬過程。膜聯(lián)蛋白在細胞中的表達和分布對機械微環(huán)境的變化高度敏感，尤其是流體流動，而AnxA6在FSS介導(dǎo)的成骨細胞礦化中的作用尚不清楚。
鑒于自噬在成骨細胞增殖和分化中的作用，以及AnxA6參與自噬過程，在四川華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究室的一項研究中，闡明了AnxA6調(diào)節(jié)的自噬在FSS介導(dǎo)的成骨細胞分化中的作用。
FSS誘導(dǎo)成骨細胞分化

為了研究FSS對骨形成的影響，首先探討了FSS如何影響機械力學(xué)敏感細胞MC3T3-E1（小鼠胚胎成骨細胞前體細胞系）的成骨分化。不同強度的FSS，分別為0（靜態(tài)對照）、5、10和20dyn/cm2，應(yīng)用于MC3T3-E1細胞1h。結(jié)果顯示，與對照組相比，F(xiàn)SS顯著促進成骨標志物ColI和ALP的表達（圖1A、B）。隨著FSS強度的增加，ColI表達上調(diào)，在20dyn/cm2組中觀察到較高表達，而ALP的表達在10dyn/cm2的條件下較高。

為了優(yōu)化FSS對成骨細胞分化的影響，在FSS強度為10dyn/cm2的情況下，對MC3T3-E1細胞施加0（靜態(tài)對照）、0.5、1、2、4h不同的加載時間。結(jié)果顯示，10dyn/cm2FSS的強度引起成骨分化相關(guān)基因Runx2、ALP和ColI的表達，在1h后增加到較高水平（圖1C、D）。此外，分別對MC3T3-E1細胞進行ALP染色和ALP活性監(jiān)測，以進一步探討FSS對成骨分化的影響。如圖1E、F，與靜態(tài)組相比，暴露于10dyn/cm21h時ALP陽性細胞增加了1.8倍。ALP活性也表現(xiàn)出3.6倍的顯著增強（圖1G）。

這些結(jié)果表明，10dyn/cm2強度的FSS持續(xù)1h有利于MC3T3-E1細胞的成骨分化。
FSS促進MC3T3-E1細胞中AnxA6的表達

為了研究AnxA6對FSS的響應(yīng)，對MC3T3-E1細胞施加0，5，10和20dyn/cm2的FSS1h。通過蛋白質(zhì)印跡測定，AnxA6在5和10dyn/cm2下表達顯著升高，但暴露于20dyn/cm2時明顯下降（圖2A、B）。

為進一步探討FSS加載持續(xù)時間對AnxA6表達的影響，在強度為10dyn/cm2下的MC3T3-E1細胞上應(yīng)用0、0.5、1、2和4h的不同加載時間的FSS。與靜態(tài)組相比，F(xiàn)SS處理1h后AnxA6升高至較高水平，而在處理0.5和4h后，AnxA6表達下降（圖2C、D）。MC3T3-E1細胞用10dyn/cm2的FSS處理1h后，AnxA6的免疫熒光強度升高（圖2E）。

這些結(jié)果表明，10dyn/cm2強度的FSS持續(xù)1h可以促進AnxA6的表達，這與圖1中Runx2、ALP和ColI的表達一致，表明AnxA6表達與成骨分化之間存在潛在相關(guān)性。
AnxA6參與FSS誘導(dǎo)的成骨分化

通過構(gòu)建穩(wěn)定的AnxA6敲低的MC3T3-E1細胞系，研究AnxA6對成骨細胞分化的影響。在MC3T3-E1細胞中，AnxA6的缺乏導(dǎo)致礦物沉積減少，ALP陽性細胞減少，ALP活性降低。成骨相關(guān)蛋白ALP和ColI表達的降低進一步證實了AnxA6缺失對成骨分化的抑制。為了進一步探索AnxA6在FSS調(diào)節(jié)的成骨中的作用，對shCtrl和shAnxA6MC3T3-E1細胞施加1h10dyn/cm2的FSS，結(jié)果表明，當暴露于10dyn/cm2的FSS1h時，shAnxA6細胞中ALP和ColI的表達恢復(fù)到較高水平，但在相同的FSS負荷下，仍然不能超過shCtrl細胞中的水平。

敲低AnxA6在FSS條件下?lián)p害自噬

接下來探討了FSS誘導(dǎo)的AnxA6是否會影響自噬。與靜態(tài)組相比，暴露于5、10和20dyn/cm2的細胞自噬標志物Beclin1、ATG5和ATG7表達較高，并伴有較多的LC3B-I轉(zhuǎn)化產(chǎn)生大量的LC3B-II，表明自噬流發(fā)生加速。

通過調(diào)節(jié)FSS持續(xù)時間進一步研究了FSS加載時間對自噬的影響。與靜態(tài)對照相比，10dyn/cm2FSS持續(xù)0.5和1h后MC3T3-E1中Beclin1、ATG5和ATG7的表達增加，而自溶酶體中可被降解破壞的p62顯著降低。這些結(jié)果表明，10dyn/cm2強度的FSS持續(xù)1h可導(dǎo)致自噬的顯著發(fā)生。

為了揭示AnxA6在FSS誘導(dǎo)的自噬中的作用，應(yīng)用1h10dyn/cm2的FSS到shCtrl和shAnxA6MC3T3-E1細胞。實驗發(fā)現(xiàn)，無論FSS負荷如何，在shCtrl組中，Beclin1和ATG5在FSS中顯著增加，而其在AnxA6敲低細胞中受到極大抑制（圖3A、B）。透射電子顯微鏡（TEM）的結(jié)果與上述蛋白質(zhì)印跡分析呈現(xiàn)相似的趨勢（圖3C）在shCtrl細胞中通過FSS誘導(dǎo)形成更多的自噬體，而AnxA6敲低細胞顯示出自噬體的數(shù)量減少。此外，暴露于FSS時細胞質(zhì)中有更多的LC3B點狀分布，表明自噬流的發(fā)生，盡管敲低AnxA6組阻礙了該過程（圖3D）。
這些結(jié)果表明，F(xiàn)SS可以通過誘導(dǎo)AnxA6誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。
 
FSS通過激活A(yù)nxA6介導(dǎo)的自噬來促進成骨分化

為了進一步剖析自噬在成骨分化和基質(zhì)礦化中的作用，實驗在體外礦化過程中使用自噬抑制劑（氯喹）和自噬激活劑（雷帕霉素）調(diào)控自噬狀態(tài)。用成骨培養(yǎng)基培養(yǎng)MC3T3-E1細胞7或14天后，氯喹對自噬的抑制大大減少了ALP陽性染色細胞的數(shù)量，并抑制了礦化結(jié)節(jié)的形成，而雷帕霉素激活自噬顯示出截然相反的效果，促進了礦化過程（圖4A、B）。此外，氯喹的添加降低了MC3T3-E1細胞中Beclin1和ATG7的表達，以及ALP和ColI的表達。另一方面，雷帕霉素上調(diào)自噬和成骨細胞分化相關(guān)蛋白表達（圖4C、D）。這些結(jié)果表明，自噬調(diào)節(jié)引起了成骨細胞分化和礦化的改變。

最后實驗研究了FSS誘導(dǎo)的AnxA6是否通過激活自噬來增強成骨細胞分化。由于敲低AnxA6在靜態(tài)和FSS條件下均導(dǎo)致自噬和成骨分化的抑制，因此雷帕霉素用于恢復(fù)AnxA6敲低抑制的自噬流，并隨后檢測成骨標志物的表達，以確定自噬在此過程中的影響。如圖4E、F，雷帕霉素的前提條件恢復(fù)了在shAnxA6組中受到抑制的ALP和ColI的表達，特別是在FSS負荷條件下。此外，ALP和ColI的表達與自噬標志物（包括Beclin1、ATG5和ATG7）的表達呈正相關(guān)。

總體而言，F(xiàn)SS通過AnxA6介導(dǎo)的自噬激活有助于成骨細胞的分化和礦化。
  MC3T3-E1細胞對外部機械力學(xué)刺激敏感。一旦FSS施加在MC3T3-E1細胞上，AnxA6就可以直接或與其他機械傳感器協(xié)同響應(yīng)FSS，伴隨著其從細胞質(zhì)到細胞膜的易位。隨后，AnxA6表達升高影響下游自噬流，并進一步調(diào)節(jié)成骨分化。

綜上所述，該研究結(jié)果表明，AnxA6調(diào)節(jié)的自噬在FSS誘導(dǎo)的成骨分化中起重要作用。實驗發(fā)現(xiàn)1h10dyn/cm2的FSS可提供足量的AnxA6來啟動自噬并增加ALP和ColI表達，導(dǎo)致成骨分化。AnxA6的敲低強烈抑制自噬，從而降低了成骨分化，而自噬激活劑恢復(fù)的自噬流也可恢復(fù)FSS對成骨分化的影響。所有這些結(jié)果為FSS誘導(dǎo)的成骨機制提供了新的見解。

參考文獻：PeiT,SuG,YangJ,GaoW,YangX,ZhangY,RenJ,ShenY,LiuX.FluidShearStress
RegulatesOsteogenicDifferentiationviaAnnexinA6-MediatedAutophagyinMC3T3-E1Cells.IntJMolSci.2022Dec11;23(24):15702.doi:10.3390/ijms232415702.PMID:365
55344;PMCID:PMC9779398.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36555344/
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