通過F-肌動蛋白和染色質(zhì)重塑的腱調(diào)蛋白表達機械拉伸誘導肌腱細胞遷移

肌腱是機械敏感組織，具有高度組織的膠原蛋白結(jié)構(gòu)，連接肌肉和骨骼，并在運動過程中充當力傳遞器。肌腱細胞是肌腱的主要功能細胞，嵌入膠原纖維束中，通過感知和響應(yīng)生物力學信號，負責維持肌腱穩(wěn)態(tài)和生物力學特性。

Tenomodulin（Tnmd，腱調(diào)蛋白）是一種II型跨膜糖蛋白，已被確定為肌腱成熟特異分子標志，在干細胞/祖細胞（TSPC）增殖、分化和衰老中起重要作用。Tnmd缺失的TSPCs也被證明表現(xiàn)出嚴重的遷移缺陷。此外，Tnmd已被確定為在發(fā)育和成年肌腱中誘導的機械敏感基因，其在肌腱中的表達與力強度相關(guān)。

細胞質(zhì)中生物力學信號的感知和翻譯高度依賴于細胞骨架。特別是，肌動蛋白細胞骨架在對機械刺激產(chǎn)生協(xié)調(diào)和定向的細胞反應(yīng)中起著機械調(diào)節(jié)作用。此外，有研究表明，肌動蛋白細胞骨架介導的染色質(zhì)組織參與了力誘導的轉(zhuǎn)錄，但該通路是否參與調(diào)節(jié)生物力學誘導的Tnmd表達還有待證明。

重慶大學生物流變科學與技術(shù)教育部重點實驗室、重慶郵電大學生物信息學院的一項研究探討了循環(huán)機械拉伸對Tnmd表達的影響，揭示了Tnmd在拉伸誘導的肌腱細胞遷移中的作用。此外還探索了導致Tnmd表達和肌腱細胞遷移的潛在機械轉(zhuǎn)導機制，重點是肌動蛋白細胞骨架介導的染色質(zhì)組織。
 
機械拉伸誘導肌腱細胞中Tnmd表達和細胞遷移

為了確認Tnmd在肌腱組織和細胞中的表達，對Tnmd進行mRNA和蛋白質(zhì)分析，與肌腱組織相比，培養(yǎng)的肌腱細胞中的Tnmd顯著降低（圖1 A、B）。接下來，分析Tnmd在加載單軸循環(huán)拉伸（10%，0.5Hz，1小時）的肌腱細胞中的基因和蛋白表達。結(jié)果表明，與未拉伸的肌腱細胞相比，Tnmd在mRNA（圖1 C）和蛋白質(zhì)（圖1 D、E）處的表達水平較高。此外，檢測機械拉伸下肌腱細胞的遷移行為。數(shù)據(jù)顯示，負載的肌腱細胞遷移顯著增加（圖1 F、G）。這些結(jié)果可推斷機械拉伸誘導的Tnmd表達與肌腱細胞遷移之間可能存在關(guān)聯(lián)。
  圖1 拉伸上調(diào)培養(yǎng)的肌腱細胞中Tnmd表達和細胞遷移。
（A）RT-qPCR檢測TnmdmRNA表達水平。（B）免疫印跡檢測肌腱組織和培養(yǎng)肌腱細胞中Tnmd蛋白水平。（C-E）分別采用RT-qPCR、WB和免疫熒光分析Tnmd在拉伸的肌腱細胞中的基因和蛋白表達。（F）測定遷移性肌腱細胞。（G）對遷移率進行了量化。

拉伸增加的Tnmd調(diào)節(jié)肌腱細胞的遷移

為了進一步研究Tnmd是否可以直接調(diào)節(jié)肌腱細胞遷移，實驗利用sh-RNA敲低Tnmd后測定肌腱細胞的遷移能力。與對照沉默組（pLKO.1）相比，Tnmd敲低組（sh-Tnmd1和sh-Tnmd2）Tnmd的mRNA和蛋白顯著降低（圖2 A、B）。此外，拉伸刺激的肌腱細胞組表現(xiàn)出比機械拉伸刺激的Tnmd敲低肌腱細胞組更高的Tnmd表達（圖2 C、D）。而且暴露于機械拉伸刺激的Tnmd敲低肌腱細胞組中肌腱細胞的遷移也顯著減少（圖2 E、F）。這些發(fā)現(xiàn)表明，肌腱細胞將機械力轉(zhuǎn)化為促進肌腱細胞遷移的Tnmd信號。
  （A、B）RT-qPCR和WB檢測TnmdmRNA和蛋白質(zhì)表達。肌腱細胞被表示為“pLKO.1”，并感染慢病毒-shcontrol。肌腱細胞被表示為“sh-Tnmd”并干擾靶向Tnmd的慢病毒。使用兩個獨立的TnmdshRNA，分別表示為sh-Tnmd1和sh-Tnmd2。（C、D）通過WB檢測Tnmd和GAPDH（拉伸對照）的蛋白表達。（E）檢測遷移性肌腱細胞。（F）對遷移進行計數(shù)和量化。

拉伸增強的肌動蛋白應(yīng)力纖維增加Tnmd表達和肌腱細胞遷移

肌動蛋白細胞骨架對于細胞內(nèi)的快速機械信號傳遞至關(guān)重要。為了探索肌動蛋白細胞骨架在拉伸誘導的Tnmd和肌腱細胞遷移中的可能作用，實驗評估了機械拉伸對F-肌動蛋白細胞骨架組織的響應(yīng)。與未拉伸組相比，拉伸的肌腱細胞表現(xiàn)出增厚的肌動蛋白應(yīng)力纖維（圖3 A、B）。為進一步研究肌動蛋白應(yīng)力纖維對拉伸誘導的Tnmd表達和肌腱細胞遷移的影響，用抑制肌動蛋白聚集藥物LatA（0.5μM）預(yù)孵育后檢測Tnmd表達和肌腱細胞遷移，LatA可以有效破壞肌動蛋白應(yīng)力纖維的形成（圖3 C、D）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與沒有LatA的拉伸肌腱細胞相比，在LatA存在下暴露于拉伸的肌腱細胞表現(xiàn)出較低的Tnmd表達。此外，在受拉伸的細胞中，肌腱細胞遷移增加，而在LatA存在下拉伸的細胞顯示肌腱細胞遷移顯著減少（圖3 F、G）。

此外，考慮到Rho相關(guān)的卷曲蛋白激酶（ROCK）是肌動蛋白應(yīng)力纖維的特異性因子，因此評估了ROCK抑制劑Y27632對拉伸增加的Tnmd表達和肌腱細胞遷移的影響。結(jié)果表明，使用Y27632抑制肌動蛋白應(yīng)力纖維可消除拉伸誘導的Tnmd表達和肌腱細胞遷移。這些結(jié)果表明，肌動蛋白應(yīng)力纖維對于誘導拉伸細胞中的Tnmd表達和肌腱細胞遷移很重要。
  （A、C）通過鬼筆環(huán)肽染色檢測F-肌動蛋白組織，用DAPI（藍色）對細胞核進行染色。右列是左側(cè)原始圖像綠色邊框的部分放大視圖。（B、D）用應(yīng)力纖維增厚（SFTI）評估和量化F-肌動蛋白細胞骨架重塑。（E）WB用于分析Tnmd蛋白的表達。（F）檢測遷移性肌腱細胞。（G）對遷移進行計數(shù)和量化。

拉伸誘導的染色質(zhì)解聚增加Tnmd表達和肌腱細胞遷移

為了確定染色質(zhì)組織是否由機械刺激介導，實驗評估了拉伸細胞中染色質(zhì)凝聚的狀態(tài)。DNaseI敏感位點（DHS）具有可接近染色質(zhì)特征。結(jié)果表明，在沒有DNaseI（脫氧核糖核酸酶I）的情況下進行拉伸的細胞的核區(qū)域與未拉伸組的細胞核區(qū)域沒有區(qū)別（圖4 A、B）。然而，DNaseI處理導致拉伸細胞中的核面積比未拉伸的細胞�。▓D4 A、B），表明機械拉伸導致染色質(zhì)解聚。

接下來，確定了染色質(zhì)解聚是否與拉伸誘導的Tnmd表達和遷移有關(guān)。兩種特異性藥物組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑（ANA）和去甲基化酶抑制劑（GSK-J4）用于抑制染色質(zhì)解聚。結(jié)果表明，與沒有抑制劑的拉伸細胞相比，ANA或GSK-J4處理的拉伸肌腱細胞中染色質(zhì)凝聚增加（圖4 C、D）。

為了確定處于凝縮狀態(tài)的染色質(zhì)對拉伸誘導的Tnmd表達和肌腱細胞遷移的影響，將肌腱細胞與ANA或GSK-J4預(yù)孵育1h，然后用拉伸刺激。結(jié)果表明，在染色質(zhì)解聚抑制劑ANA和GSK-J4存在下暴露于拉伸的肌腱細胞在mRNA水平上Tnmd的表達較低（圖4 E）。此外發(fā)現(xiàn)，與拉伸的肌腱細胞相比，在ANA處理的拉伸細胞或GSK-J4處理的拉伸細胞中，Tnmd蛋白表達和肌腱細胞遷移被消除（圖4 F-H）。這些結(jié)果表明，組蛋白甲基化和乙�；�引起的染色質(zhì)解聚可能有助于拉伸誘導的Tnmd表達和肌腱細胞遷移。
  圖4 解凝染色質(zhì)有助于拉伸肌腱細胞中的Tnmd表達和腱細胞遷移。
（A、C）通過原位DNaseI靈敏度檢測染色質(zhì)凝聚。（B、D）用核面積評估和量化染色質(zhì)凝聚的程度。（E）TnmdmRNA表達的RT-qPCR檢測。（F）WB用于分析Tnmd蛋白的表達。（G）檢測遷移性肌腱細胞。（H）對遷移進行計數(shù)和量化。

綜上所述，該研究結(jié)果表明，肌動蛋白應(yīng)力纖維的形成和染色質(zhì)解聚可調(diào)節(jié)Tnmd表達，從而可能調(diào)節(jié)肌腱細胞遷移。因此，該研究提出了肌動蛋白和染色質(zhì)機械轉(zhuǎn)導通路參與Tnmd調(diào)控，并揭示了Tnmd在肌腱細胞遷移中的新作用。Tnmd在肌腱細胞遷移中的功能鑒定為Tnmd介導的肌腱修復所涉及的分子機制提供了見解。

參考文獻：Xu P, Deng B, Zhang B, Luo Q, Song G. Stretch-Induced Tenomodulin Expression Promotes Tenocyte Migration via F-Actin and Chromatin Remodeling. Int J Mol Sci. 2021 May 6;22(9):4928. doi: 10.3390/ijms22094928. PMID: 34066472; PMCID: PMC8124537.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34066472/

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