動(dòng)員外周血單個(gè)核細(xì)胞分離方法和注意事項(xiàng)

正常人外周血中的干/祖細(xì)胞的含量占有核細(xì)胞數(shù)的1%左右，經(jīng)有效動(dòng)員后，骨髓中的造血干細(xì)胞會(huì)釋放到外周血中，使外周血中的干/祖細(xì)胞比例明顯增高。動(dòng)員外周血是指用有效的動(dòng)員劑對供者進(jìn)行動(dòng)員后采集的外周血。重組人粒細(xì)胞集落刺激因子（rhG-CSF）是外周血?jiǎng)訂T最常用的動(dòng)員劑，它可選擇性的作用于粒系造血祖細(xì)胞，促進(jìn)其增殖、分化，并可增加外周血中性粒細(xì)胞的數(shù)目和功能。動(dòng)員外周血單個(gè)核細(xì)胞是采集經(jīng)動(dòng)員后的健康供者的外周血，采用密度梯度離心的方法提取其單個(gè)核細(xì)胞，其各亞型細(xì)胞的數(shù)量、細(xì)胞免疫表型、分泌細(xì)胞因子能力和增殖能力等可能會(huì)與未動(dòng)員外周血有一定差異。

1    原理

單個(gè)核細(xì)胞的體積、形態(tài)和比重與其它細(xì)胞不同，在沉降過程中不同比重的細(xì)胞會(huì)處于不同的分布位置。因此，可利用各種血細(xì)胞和單個(gè)核細(xì)胞比重之間的差異將各種血細(xì)胞與單個(gè)核細(xì)胞分離開來。

2    方法

1）  取新鮮抗凝動(dòng)員外周血，按照1：1比例加入1×稀釋洗滌液，將血液進(jìn)行稀釋（以降低血液粘稠度），輕柔混勻，備用。

2）  向無菌離心管內(nèi)加入適量的單個(gè)核細(xì)胞分離液，將稀釋后的血樣平鋪到分離液液面上方（分離液：稀釋動(dòng)員外周血=1：2），保持兩液面界面清晰。

3）  800g，室溫，離心 20min-30min（注：設(shè)置較慢的加速度和減速度，如果有十檔，設(shè)為第三檔）。

4）  離心結(jié)束后，吸棄血漿層，小心吸取PBMC層（即白膜層）并轉(zhuǎn)移至15mL離心管中。離心結(jié)束后，管內(nèi)液面從上至下依次為稀釋血漿層、PBMC層、分離液層和紅細(xì)胞層（見圖1）。

圖1 稀釋動(dòng)員外周血離心前后的分層狀態(tài)圖

5）  向離心管中加入10mL 重懸細(xì)胞，250g，室溫離心 10min ，棄上清。重復(fù)該步驟 1~2 次，即可用于后續(xù)試驗(yàn)。

3    注意事項(xiàng)

1）  血液新鮮程度是影響分離效果的關(guān)鍵因素，請盡量使用采集后24h內(nèi)的血液進(jìn)行PBMC分離。

2）  為保證細(xì)胞的活力，整個(gè)操作過程請輕柔，避免對細(xì)胞造成機(jī)械性的損傷。

3）  為保持細(xì)胞狀態(tài)良好，請盡量縮短整個(gè)試驗(yàn)的周期。

4    動(dòng)員外周血單個(gè)核細(xì)胞分離試劑盒

IPHASE/匯智和源針對動(dòng)員外周血單個(gè)核細(xì)胞分離的特點(diǎn)，開發(fā)了對應(yīng)的單個(gè)核細(xì)胞分離試劑盒。該試劑盒包含單個(gè)核細(xì)胞分離液和洗滌液兩個(gè)組分，各成分對細(xì)胞無毒性，不會(huì)影響細(xì)胞的原始狀態(tài)；同時(shí)，該試劑盒操作簡單便捷，可大大縮短細(xì)胞分離時(shí)間，分離所得細(xì)胞純度高、狀態(tài)好、得率高。

5    相關(guān)產(chǎn)品

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