胰腺癌細(xì)胞中的機(jī)械應(yīng)力信號(hào)觸發(fā)細(xì)胞骨架重塑并促進(jìn)細(xì)胞遷移

胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）占胰腺癌病例的 90% 以上，PDAC的特征是預(yù)后極差。目前的研究重點(diǎn)是使PDACs的微環(huán)境正�；�。PDAC微環(huán)境的特征是由細(xì)胞外蛋白（如膠原蛋白I和透明質(zhì)酸）組成的致密腫瘤相關(guān)基質(zhì)，這些蛋白被重塑以產(chǎn)生僵硬的細(xì)胞外基質(zhì)，這種情況稱(chēng)為纖維增生。

氯沙坦通過(guò)其轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGFβ）抑制活性，已在臨床上作為靶向致密基質(zhì)的方法進(jìn)行了測(cè)試�；�質(zhì)硬度增加也可作為診斷標(biāo)志物，與預(yù)后不良有關(guān)。它可以激活黏著斑蛋白，如局部黏著斑激酶（FAK）和樁蛋白，以及肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重塑蛋白，如RAC，RHO GTPase/Rho相關(guān)激酶（ROCK）和RAS GTPases，以觸發(fā)誘導(dǎo)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，遷移和侵襲的信號(hào)級(jí)聯(lián)。此外，在物理受限環(huán)境中的腫瘤生長(zhǎng)也導(dǎo)致腫瘤內(nèi)部機(jī)械壓縮力的發(fā)展，導(dǎo)致腫瘤內(nèi)壓縮應(yīng)力可達(dá)到75 mmHg（10 kPa）。這種類(lèi)型的機(jī)械應(yīng)力已被證明可以激活促進(jìn)腫瘤發(fā)生和侵襲性的信號(hào)通路。

塞浦路斯大學(xué)癌癥生物物理學(xué)實(shí)驗(yàn)室、美國(guó)匹茲堡大學(xué)生物工程系、俄勒岡健康與科學(xué)大學(xué)奈特癌癥研究所等研究團(tuán)隊(duì)的人員假設(shè)機(jī)械應(yīng)力激活了在胰腺腫瘤中被持續(xù)激活的信號(hào)通路。這些通路包括參與細(xì)胞存活和運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)的PI3K/AKT和RAS/MAPK信號(hào)級(jí)聯(lián)。RAS/MAPK信號(hào)通路的增加可能是由于K-Ras是侵襲性胰腺腫瘤中zui常見(jiàn)的突變基因。K-Ras可以激活PI3K / AKT通路，但其主要靶點(diǎn)是MAPK信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，包括c-Jun N端激酶（JNK）和p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）。在該團(tuán)隊(duì)以前的研究中，發(fā)現(xiàn)機(jī)械應(yīng)力通過(guò)激活胰腺癌和腦癌細(xì)胞系中的P13K / AKT和MEK1 / ERK1信號(hào)級(jí)聯(lián)來(lái)促進(jìn)生長(zhǎng)分化因子15（GDF15）誘導(dǎo)的癌細(xì)胞遷移。在這些發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，他們又使用蛋白質(zhì)組學(xué)測(cè)定來(lái)鑒定機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，這可能有助于胰腺癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)。研究結(jié)果闡明了機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制，并確定限制胰腺癌細(xì)胞遷移的治療靶點(diǎn)。 蛋白質(zhì)組學(xué)分析揭示了跨多個(gè)通路的異質(zhì)反應(yīng)，并揭示了p38 MAPK / HSP27和JNK / c-Jun作為胰腺癌細(xì)胞中機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)的信號(hào)通路的激活

為了研究胰腺癌細(xì)胞中機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)的信號(hào)通路，實(shí)驗(yàn)分析了在胰腺癌細(xì)胞上施加壓縮力后的總蛋白和磷酸化蛋白水平。使用胰腺癌細(xì)胞系MIA PaCa-2和PANC-1（攜帶KRAS突變），將 MIA PaCa-2 細(xì)胞置于壓力裝置下施加4.0 mmHg的壓縮力。

對(duì)照細(xì)胞和壓縮細(xì)胞之間倍數(shù)變化zui大（20%）的蛋白質(zhì)增加（紅色）或減少（藍(lán)色）在熱圖中可視化（圖1 A）。研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)械應(yīng)力激活了許多調(diào)節(jié)因子，介導(dǎo)細(xì)胞適應(yīng)多種應(yīng)激信號(hào)，包括熱休克應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、炎癥應(yīng)激和氧化應(yīng)激。具體而言，細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)介質(zhì)，熱休克蛋白27（HSP27_pS82）及其上游激活劑 p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK_pT180_Y182）在壓縮細(xì)胞中表現(xiàn)出與對(duì)照細(xì)胞相比的強(qiáng)激活，這也通過(guò)免疫印跡在 MIA PaCa-2 和 PANC-1 細(xì)胞中得到驗(yàn)證（圖1 B、C、C、E、H）。根據(jù)p38 MAPK的激活，發(fā)現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)蛋白c-Jun JNK的下游靶點(diǎn)c-Jun（pS73）也在壓縮細(xì)胞中被激活。隨后通過(guò)免疫印跡驗(yàn)證c-Jun和JNK的激活（圖1 F-H）。細(xì)胞應(yīng)激的其他標(biāo)志物，包括微管相關(guān)蛋白1A/1B 輕鏈3B（LC3）A-B（自噬體標(biāo)志物）和內(nèi)質(zhì)網(wǎng) （ER）應(yīng)激傳感器伴侶免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白（BiP）-葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白（GRP78）（也稱(chēng)為 HSP70），也因受到壓縮力而升高（圖1 A）。

在前10種上調(diào)蛋白中，觀(guān)察到與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架組織和細(xì)胞收縮有關(guān)的纖溶酶原激活物抑制劑-1（PAI-1）的強(qiáng)烈上調(diào)。PAI-1的作用由肌球蛋白II的下游激活介導(dǎo)，它與肌動(dòng)蛋白絲相互作用形成肌動(dòng)球蛋白，允許細(xì)胞收縮，從而使細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和侵襲。事實(shí)上，肌球蛋白II也在壓縮細(xì)胞中被激活，如圖1 A。這些介質(zhì)的表達(dá)和磷酸化的增加可能有助于在機(jī)械壓縮下增強(qiáng)細(xì)胞的遷移。

另一方面，機(jī)械應(yīng)力下調(diào)了哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶標(biāo)（mTOR）通路的多個(gè)靶點(diǎn)，包括p70-S6K_pT389、Rictor_pT1135、4E-BP1_pS65和mTOR_pS2448，它們促進(jìn)蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞生長(zhǎng)增殖（圖1 A）。為了評(píng)估機(jī)械應(yīng)力如何改變信號(hào)通路，計(jì)算了九個(gè)主要通路的通路評(píng)分，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期通路的多個(gè)蛋白質(zhì)成員（p27_pT157，細(xì)胞周期蛋白E1、B1、D1）和結(jié)節(jié)性硬化癥復(fù)合體（TSC）/mTOR通路減少。相比之下，PI3K/Akt和Ras/MAPK信號(hào)通路的蛋白質(zhì)成員升高（圖1 F）。

總的來(lái)說(shuō)，結(jié)果表明，機(jī)械應(yīng)力激活細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)介質(zhì)和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)因子，這可能觸發(fā)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)并損害細(xì)胞周期進(jìn)程和增殖。
機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重塑和胰腺癌細(xì)胞收縮，促進(jìn)其遷移能力

接下來(lái)評(píng)估壓縮下MIA PaCa-2和PANC-1胰腺癌細(xì)胞系中肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架組織的變化。實(shí)驗(yàn)觀(guān)察到，壓縮的MIA PaCa-2和PANC-1（圖2 A、B）與未壓縮的細(xì)胞相比，應(yīng)力纖維、絲狀偽足和片狀偽足形成增加。同時(shí)，壓縮細(xì)胞的圓度降低，縱橫比增加。此外，發(fā)現(xiàn)壓縮的MIA PaCa-2和PANC-1細(xì)胞中的磷酸肌球蛋白II水平增加。壓縮細(xì)胞中磷酸肌球蛋白II也與肌動(dòng)蛋白絲共定位（圖2 C、D），提示肌動(dòng)球蛋白收縮力增加。

為了評(píng)估細(xì)胞骨架的這些變化是否促進(jìn)機(jī)械應(yīng)力下的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，進(jìn)行了劃傷試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)與未壓縮的細(xì)胞相比，壓縮的PANC-1細(xì)胞表現(xiàn)出更高的遷移能力（圖2 E、F）。基于細(xì)胞形狀細(xì)長(zhǎng)和遷移增加的結(jié)果，用qPCR分析了上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）基因SNAIL、SLUG和TWIST的表達(dá)。這些基因在兩種細(xì)胞系中均上調(diào)，進(jìn)一步驗(yàn)證了壓縮細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性增強(qiáng)（圖2 G）。

zui后，實(shí)驗(yàn)還檢查了Rac1和cdc42 GTPases的激活，它們通過(guò)誘導(dǎo)肌球蛋白II活化來(lái)調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架組織以形成細(xì)胞突起和肌動(dòng)球蛋白收縮力。事實(shí)上，G-LISA表明，Rac家族小GTPase1（Rac1）早在細(xì)胞暴露于壓縮后30分鐘就被激活，而細(xì)胞分裂周期因子42（cdc42）GTPase在16小時(shí)被激活（圖2 H），這表明可能是機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)的 Rac1/cdc42/肌球蛋白 II 軸的激活。同時(shí)，細(xì)胞活力試驗(yàn)和Ki67免疫染色增殖試驗(yàn)顯示，在壓縮后至少16小時(shí)內(nèi)，與對(duì)照MIA PaCa-2和PANC-1細(xì)胞相比，壓縮后的細(xì)胞沒(méi)有顯著變化。但壓縮后48小時(shí)細(xì)胞增殖減少。

總之，結(jié)果表明，在細(xì)胞適應(yīng)的前16小時(shí)內(nèi)，機(jī)械應(yīng)力通過(guò)Rac1 / cdc42 / 肌球蛋白II軸和基因表達(dá)改變誘導(dǎo)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的變化以觸發(fā)細(xì)胞遷移。
p38 MAPK/HSP27和JNK/c-Jun通路是胰腺癌細(xì)胞在機(jī)械應(yīng)力下遷移所必需的

為了評(píng)估應(yīng)激反應(yīng)通路p38 MAPK / HSP27和JNK / c-Jun的激活是否在機(jī)械應(yīng)力下細(xì)胞遷移潛力的增加中起作用，實(shí)驗(yàn)用p38 MAPK（SB202190）或JNK（SB202190）抑制劑處理MIA PaCa-2和PANC-1細(xì)胞。接下來(lái)進(jìn)行了劃痕試驗(yàn)，觀(guān)察到當(dāng)用任何一種抑制劑在加壓下處理時(shí)，MIA PaCa-2和PANC-1癌細(xì)胞的遷移顯著減少（圖3 A-C），而當(dāng)用相同濃度（15 μmol/L）的任一抑制劑處理未壓縮細(xì)胞時(shí)，未觀(guān)察到任何效果。Ki67染色顯示細(xì)胞增殖也被有效抑制（圖3 D、E）。為了進(jìn)一步證實(shí)結(jié)果，用siRNA處理p38 MAPK alpha 和JNK1/2的細(xì)胞，對(duì)siRNA處理的對(duì)照和壓縮細(xì)胞進(jìn)行了劃痕測(cè)定。實(shí)驗(yàn)觀(guān)察到，與各自的未壓縮細(xì)胞相比，只有用sip38 MAPK或 siJNK1/2處理的壓縮細(xì)胞的遷移能力下降。與細(xì)胞遷移的減少和EMT標(biāo)志物的表達(dá)一致，用任一抑制劑處理的壓縮細(xì)胞中的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架染色顯示細(xì)胞突起減少以及應(yīng)力纖維形成。細(xì)胞形態(tài)的定量表明，用任何一種抑制劑處理細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞長(zhǎng)寬比降低，細(xì)胞圓度增加。

總的來(lái)說(shuō)，結(jié)果表明，機(jī)械應(yīng)力可以導(dǎo)致p38 MAPK和JNK信號(hào)通路的激活，這些通路是肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重塑和癌細(xì)胞遷移所必需的，也是維持壓縮細(xì)胞增殖所必需的。
Rac1-和cdc42-GTPases介導(dǎo)機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)的細(xì)胞骨架變化，促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞遷移

因?yàn)闄C(jī)械應(yīng)力會(huì)誘發(fā)細(xì)胞突起、絲狀偽足和片狀偽足（圖2 A、B），并且由于這些結(jié)構(gòu)受RAC1和cdc42小GTPases 的調(diào)節(jié)，實(shí)驗(yàn)用針對(duì)RAC1和CDC42的siRNA處理MIA PaCa-2和PANC-1細(xì)胞，并進(jìn)行劃痕愈合實(shí)驗(yàn)和鬼筆環(huán)肽染色，以檢查它們?cè)诮閷?dǎo)壓縮效應(yīng)中的作用。確認(rèn)這些基因的成功敲低（圖4 A、B），觀(guān)察到siRac1處理的細(xì)胞對(duì)傷口閉合的強(qiáng)烈抑制，而在sicdc42處理的細(xì)胞中作用較弱（圖4 C-E）。此外，肌動(dòng)蛋白應(yīng)激纖維、絲狀偽足和片狀偽足形成減少，細(xì)胞縱橫比減少，細(xì)胞圓度增加。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，盡管肌球蛋白II在siRNA處理的壓縮細(xì)胞中被激活，但肌動(dòng)球蛋白的形成減少。

為了確定RAC1和CDC42下調(diào)與JNK或p38 MAPK激活之間的相互作用，進(jìn)行了免疫印跡，發(fā)現(xiàn)JNK和p38 MAPK激活在RAC1或CDC42敲低后不受影響。此外，用siRac1或sicdc42處理不影響MIA PaCa-2或PANC-1細(xì)胞的增殖（圖4 F）。

總的來(lái)說(shuō)，結(jié)果表明，p38 MAPK和JNK在機(jī)械應(yīng)力下的激活，維持細(xì)胞活力，并不依賴(lài)于Rac1和cdc42 GTPases，而這些GTPases 是肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重組和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)所必需的。

機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)的信號(hào)通路，驅(qū)動(dòng)胰腺癌細(xì)胞遷移。在宿主組織的受限環(huán)境中，胰腺腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生機(jī)械壓縮力。這些力通過(guò)激活JNK / c-Jun，p38 MAPK / HSP27，Rac1和cdc42在細(xì)胞內(nèi)傳遞各自的固體應(yīng)力。p38 MAPK/HSP27和JNK/c-Jun信號(hào)軸的激活可以通過(guò)驅(qū)動(dòng)細(xì)胞在壓縮下的增殖來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)新環(huán)境的適應(yīng)。Rac1和cdc42依次被激活，并且可以調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重塑，以形成逐漸改變細(xì)胞形狀的細(xì)胞突起。Rac1和cdc42也介導(dǎo)肌動(dòng)球蛋白收縮性，zui終在壓縮下促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞遷移。

總的來(lái)說(shuō)，該研究結(jié)果建立了一種新的機(jī)制，通過(guò)激活p38 MAPK / HSP27和JNK / c-Jun信號(hào)軸以及肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重塑因子Rac1，cdc42和肌球蛋白II 來(lái)促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。研究結(jié)果強(qiáng)調(diào)，靶向適應(yīng)機(jī)械腫瘤微環(huán)境的腫瘤細(xì)胞中的異常信號(hào)是一種阻止腫瘤遷移的新方法。

參考文獻(xiàn)：Kalli M, Li R, Mills GB, Stylianopoulos T, Zervantonakis IK. Mechanical Stress Signaling in Pancreatic Cancer Cells Triggers p38 MAPK- and JNK-Dependent Cytoskeleton Remodeling and Promotes Cell Migration via Rac1/cdc42/Myosin II. Mol Cancer Res. 2022 Mar 1;20(3):485-497. doi: 10.1158/1541-7786.MCR-21-0266. PMID: 34782370; PMCID: PMC8898300.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34782370/

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