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將自動化和基礎(chǔ)發(fā)現(xiàn)融入非傳統(tǒng)微生物的設(shè)計-構(gòu)建-測試-學(xué)習(xí)循環(huán)方法
將自動化和基礎(chǔ)發(fā)現(xiàn)融入非傳統(tǒng)微生物的設(shè)計-構(gòu)建-測試-學(xué)習(xí)循環(huán)方法
目錄/CONTENT
02/用于生物生產(chǎn)的傳統(tǒng)和新興微生物平臺的調(diào)查
03/生物鑄造廠利用模型微生物宿主推進生物生產(chǎn)
04/生物鑄造廠的細(xì)胞工廠設(shè)計和測試自動化
05/通過自動化和擴展合成生物學(xué)工具箱，為基于非傳統(tǒng)宿主的細(xì)胞工廠鋪平道路
06/引入以代謝為中心的分析作為發(fā)現(xiàn)平臺，指導(dǎo) DBTL 循環(huán)中的工程工作
07/觀點總結(jié)和未來方向
08/未解決的問題
生物基工業(yè)的重大進展使多種化學(xué)品的生物生產(chǎn)具有成本效益，但成功的工業(yè)過程相對稀缺，并且僅限于使用少數(shù)主力微生物作為宿主。深入了解非傳統(tǒng)微生物的生理學(xué)和代謝是釋放其生物技術(shù)潛力的關(guān)鍵。生物鑄造廠的誕生使構(gòu)建和測試大量為生物生產(chǎn)量身定制的微生物菌株的能力成倍增加——作者認(rèn)為其中的自動化工作流程可以適應(yīng)獲得非傳統(tǒng)宿主的基本知識。在這里，作者提出了一種“以代謝為中心”的合成生物學(xué)設(shè)計-構(gòu)建-測試-學(xué)習(xí)循環(huán)的方法，并得到多組學(xué)分析的支持。
01 要點
由于合成生物學(xué)工具集和基礎(chǔ)知識有限，用于生物生產(chǎn)的非傳統(tǒng)宿主仍未得到充分開發(fā)。多組學(xué)方法能夠?qū)ξ⑸锎x進行系統(tǒng)級理解——將工程工作作為設(shè)計-構(gòu)建-測試-學(xué)習(xí) (DBTL：design–build–test–learn) 循環(huán)的基本要素來指導(dǎo)。生物鑄造廠能夠在創(chuàng)紀(jì)錄的時間內(nèi)生成和測試數(shù)百種微生物菌株——但對常見和非傳統(tǒng)宿主代謝特征的探索并未完全納入管道。自動化在合成生物學(xué)和代謝工程中發(fā)揮著核心作用，除了減少工作流程時間外，還可以用作指導(dǎo)工程工作的發(fā)現(xiàn)工具。
DBTL 循環(huán)中以代謝為中心的觀點有望加速細(xì)胞工廠組裝工作流程，同時提供有關(guān)基本生物學(xué)問題的關(guān)鍵信息。
02 用于生物生產(chǎn)的傳統(tǒng)和新興微生物平臺的調(diào)查
可持續(xù)化學(xué)生產(chǎn)在不斷發(fā)展的生物基行業(yè)中占據(jù)了穩(wěn)固的地位，以替代目前幾乎完全來自化石資源的產(chǎn)品。生物底盤是使用代謝工程工具定制的，該工具產(chǎn)生多功能生物生產(chǎn)平臺（即細(xì)胞工廠），用于合成廣泛的大宗和精細(xì)化學(xué)品——支持更可持續(xù)、更綠色的社會。
盡管對高價值（生物）產(chǎn)品的需求不斷增長，繼續(xù)以前所未有的速度加速細(xì)胞工廠的發(fā)展，但為生物生產(chǎn)創(chuàng)建強大的微生物平臺是一項相對手工且耗時的工作。此外，難以合成的化合物——無論是由于其毒性還是因為它們是新的自然物質(zhì)，沒有可用于合成的天然生物催化劑，仍在等待大規(guī)模生產(chǎn)。實現(xiàn)這一目的的工程細(xì)胞工廠需要一個多步驟的設(shè)計和執(zhí)行策略，從生化網(wǎng)絡(luò)的計算機模擬到與規(guī)模相關(guān)的生物反應(yīng)器中所需代謝物的實際生物生產(chǎn)。
整個過程所需的時間跨度取決于幾個方面；首先，用于選定宿主基因組工程的遺傳元件（即部分）的可用性和可及性；其次，評估包含實驗室規(guī)模生物生產(chǎn)所需修改的初始原型；最后，優(yōu)化不同的參數(shù)以增加滴度并最大化目標(biāo)化合物的通量以及生物工藝放大。
在滿足與工業(yè)規(guī)模生物生產(chǎn)兼容的關(guān)鍵性能參數(shù) 之前，此序列的迭代對于提高工程底盤的性能是必要的。革蘭氏陰性細(xì)菌大腸桿菌和酵母釀酒酵母是常規(guī)用于構(gòu)建細(xì)胞工廠的常規(guī)底盤。對其生理學(xué)和遺傳學(xué)的深入了解，以及廣泛的遺傳工具的可用性，使這些微生物在爭取最佳生物生產(chǎn)平臺的競賽中處于領(lǐng)先地位。許多例子展示了如何對大腸桿菌進行工程改造以產(chǎn)生大量化合物，例如生物燃料、大宗化學(xué)品、天然產(chǎn)物和聚羥基鏈烷酸酯。
同樣，酵母細(xì)胞工廠進一步擴展了可從可再生基質(zhì)生產(chǎn)的目標(biāo)化學(xué)品組合。工程釀酒酵母生產(chǎn)的多種生物基化學(xué)品（例如有機酸和脂肪酸、生物燃料、類異戊二烯、芳烴和聚酮）說明了這一點。大多數(shù)這些細(xì)胞工廠的工業(yè)相關(guān)性僅限于原理驗證嘗試——除了重組蛋白生產(chǎn)和一些大宗化學(xué)品的生物合成。大規(guī)模發(fā)酵中的高產(chǎn)品滴度和穩(wěn)健性，對于工業(yè)應(yīng)用同樣必要，但在此類試點研究中很少成功實現(xiàn)。
這些性能指標(biāo)與宿主的新陳代謝和生理學(xué)密切相關(guān)，這使得穩(wěn)定生產(chǎn)參數(shù)等性狀難以設(shè)計。例如，大腸桿菌對底物和氧氣梯度的敏感性，由于混合限制，在大型生物反應(yīng)器中經(jīng)常遇到，是一個長期存在的問題，只是部分解決了。同樣，大腸桿菌和酵母的溢出代謝規(guī)定了僅限于低底物濃度的糖喂養(yǎng)政策，并放大了與底物梯度相關(guān)的問題。因此，具有獨特或額外優(yōu)勢特性的非傳統(tǒng)宿主成為替代微生物候選者，因為它們在生產(chǎn)特定化合物方面表現(xiàn)出增強的性能，或者因為它們可以抵抗工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)中典型的惡劣條件。此外，非傳統(tǒng)宿主能夠使用替代原料，例如 C1 化合物作為 CO2，規(guī)避與其他工業(yè)過程和食品生產(chǎn)的競爭。
在許多其他有希望的微生物中，細(xì)菌種類天藍(lán)色鏈霉菌、丙酮丁醇梭菌、枯草芽孢桿菌、谷氨酸棒桿菌和紅球菌屬，以及真核生物曲霉屬和 Rhodotorula toruloides 屬于非傳統(tǒng)生物生產(chǎn)平臺的廣泛類別。（表格1）說明了這些微生物的一些關(guān)鍵特征，例如，它們產(chǎn)生特定類型分子的能力、對有毒化合物和極端培養(yǎng)條件的耐受性、遺傳工具的可用性、底物范圍和快速生長速度。
這些物種已經(jīng)找到了以生物技術(shù)生產(chǎn)大宗和精細(xì)化學(xué)品的方式，無論是代謝工程菌株的形式，還是通過長期選擇性培養(yǎng)計劃獲得的過度生產(chǎn)變體的形式。這種類型的另一個突出例子是革蘭氏陰性細(xì)菌惡臭假單胞菌，這都是由于合成生物學(xué)工具的可用性——不斷擴大——以及對化學(xué)和氧化應(yīng)激的顯著耐受性。然而，這些微生物在代謝工程和工業(yè)應(yīng)用方面仍未得到充分利用，因為在基因型與表型關(guān)系及其代謝網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)方面存在顯著的知識差距。
擴大對微生物代謝的了解對于擴大可以“馴化”為細(xì)胞工廠的微生物底物的種類是必不可少的。在大多數(shù)非傳統(tǒng)微生物中，關(guān)于 DNA 修飾如何影響表型或代謝網(wǎng)絡(luò)如何在幾個調(diào)節(jié)水平上相互作用的問題仍然不清楚。了解基因型與表型之間的關(guān)系需要充分利用合成生物學(xué)工具，實現(xiàn)合理和靶向的 DNA 修飾，以及全面探索代謝的動態(tài)行為，將物理化學(xué)或生化擾動與表型變化聯(lián)系起來。
目前，解決這些挑戰(zhàn)的大多數(shù)努力都集中在開發(fā)新的工具來設(shè)計非模型微生物。同時，微生物原型的深入多組學(xué)分析正在為模型生物提供動力，允許以前所未有的細(xì)節(jié)探索細(xì)胞中的多個調(diào)控層。盡管這些策略是必要的，但它們通常不足以調(diào)查非傳統(tǒng)微生物作為生物生產(chǎn)平臺的潛力——在這種平臺上，缺乏對整個生物實體的系統(tǒng)理解。因此，合理設(shè)計、多組分?jǐn)?shù)據(jù)集成、預(yù)測模型和自動化的智能組合對于構(gòu)建高效的細(xì)胞工廠、擴展基礎(chǔ)知識和指導(dǎo)代謝工程至關(guān)重要。
表格1 在工業(yè)生物技術(shù)中被選擇的替代微生物的關(guān)鍵特征
03 生物鑄造廠利用模型微生物宿主推進生物生產(chǎn)
設(shè)計、建造和測試電池工廠在工作量、時間和成本方面都很苛刻。這些活動中的大多數(shù)仍以（半）手工的方式沿著被稱為合成生物學(xué)設(shè)計-構(gòu)建-測試-學(xué)習(xí)（DBTL）循環(huán)的迭代工作流程進行。生物鑄造廠的出現(xiàn)旨在加速和自動化這一序列，同時提高一致性、通量和降低勞動力成本。
因此，生物鑄造廠的主要目標(biāo)是簡化化學(xué)生產(chǎn)的微生物底盤工程。然而，生物鑄造管道的最終產(chǎn)品，即細(xì)胞工廠，只是一個工業(yè)級生物生產(chǎn)平臺的起點。一個整合的生物過程絕不是在那個階段完成的，而且在升級階段必須投入大量的時間和成本，這通常涉及到重新設(shè)計或升級細(xì)胞工廠的某些功能，或者選擇完全不同的微生物宿主。幸運的是，合成生物學(xué)和多組學(xué)方法學(xué)的最新進展為加強生物鑄造廠的作用提供了強有力的框架。在這個結(jié)構(gòu)中，作者提出了 DBTL 循環(huán)的升級版本，其中“以代謝為中心” 的觀點——而不是更傳統(tǒng)的以基因組為中心的方法——有助于揭示生物技術(shù)相關(guān)微生物的表型復(fù)雜性。
在這里，作者將生物鑄造廠作為一個自動化平臺來擴展對非傳統(tǒng)微生物的知識——以及如何利用這些信息來定制強大的細(xì)胞工廠。作者還概述了快速構(gòu)建主流宿主和替代宿主的多種突變變體的最新工具箱發(fā)展，重點是下一代宿主 P. putida。在這種情況下，生物鑄造廠被提議作為一個功能接口，在該接口中，組學(xué)技術(shù)的集成使得幾乎任何微生物底盤都能得到合理的操縱—— 新陳代謝是這種發(fā)展的核心驅(qū)動力——從而實現(xiàn)細(xì)胞工廠的全自動化部署。
04 生物鑄造廠的細(xì)胞工廠設(shè)計和測試自動化
自動化技術(shù)正日益融入合成生物學(xué)和代謝工程。通常，構(gòu)建一個含有相對簡單的合成代謝途徑的細(xì)胞工廠需要至少十個單獨的 DNA 模塊。這些遺傳部分必須以多種配置進行重新排列，以產(chǎn)生以合理滴度產(chǎn)生所需產(chǎn)物的變體——這使得人工構(gòu)建 DNA 組裝既不切實際又耗時。相比之下，自動化為細(xì)胞工廠設(shè)計和建造提供了高效、標(biāo)準(zhǔn)化的解決方案。
一個主要的挑戰(zhàn)是以快速有效的方式測試植入給定宿主的基因構(gòu)建體的大組合，同時了解每個修飾對最終表型的生物學(xué)意義。生物鑄造廠擁有在由機器人液體處理器控制的集成分子生物學(xué)設(shè)施中處理大量遺傳構(gòu)建體的能力，結(jié)合高通量分析并由專用軟件支持。DNA 構(gòu)建體快速原型的生物鑄造簡化方案如圖1A所示。學(xué)術(shù)生物鑄造廠的一個值得注意的方面是，整個工作流程仍然沒有完全自動化或在 DBTL 周期的所有級別進行集成。細(xì)胞 工廠建設(shè)中的中間步驟需要廣泛的優(yōu)化，大部分在平臺外手動（至少部分）執(zhí)行。
此外，到目前為止，自動化在提供關(guān)于新陳代謝的深刻基礎(chǔ)信息方面的能力還沒 有得到充分利用。
圖1.自動化生物鑄造廠微生物生理學(xué)和代謝的基本發(fā)現(xiàn)。（A） 微生物原型自動化平臺的總體方案。機器人液體處理器組件根據(jù)其功能以不同的顏色或位置顯示。該平臺包括 PCR 機（黃色）、電穿孔站（淺藍(lán)色）、培養(yǎng)裝置（綠色）、 分光光度計（淺紅色）、搬運機械臂（頂部）、尖端盒（白色）和快速過濾裝置（右側(cè)，淺橙色）。所有這些組件都放在一個化學(xué)罩中。（B）通過快速質(zhì)粒構(gòu)建、轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒純化、治愈和基因分型介導(dǎo)的自動基因組工程。流水線中的不同步驟如下：（i）通過 PCR 從標(biāo)準(zhǔn)零件（標(biāo)準(zhǔn)歐洲載體結(jié)構(gòu)，SEVA）進行遺傳零件組裝；（ii）將 PCR 產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為化學(xué)活性大腸桿菌，隨后進行測序確認(rèn)；（iii）質(zhì)粒 DNA 純化和轉(zhuǎn)化為非傳統(tǒng)目的宿主；和（iv）單個克隆的質(zhì)粒固化和基因型檢查。整個過程原則上可以在4-5 天內(nèi)完成，并在基本上任何革蘭氏陰性細(xì)菌宿主上產(chǎn)生菌株變體庫�？s寫：OD，光密度；PCR、聚合酶鏈反應(yīng)。
傳統(tǒng)微生物宿主（主要是大腸桿菌）的正向工程在 DBTL 循環(huán)的設(shè)計-構(gòu)建階段利用了生物鑄造廠的潛力。最近的兩個例子說明了工程大腸桿菌用于（2S）-黃烷酮和十二醇生物生產(chǎn)的半自動化方法。第一個例子是通過在自動化管道中組裝表達(dá)構(gòu)建體的組合文庫來優(yōu)化不同類黃酮的生物合成過程。基因部分被設(shè)計為通過連接酶循環(huán)反應(yīng)與 DNA 組裝完全兼容，并通過液體處理機器人平臺執(zhí)行計算機移液工作流程。
應(yīng)用這種半自動 DBTL 程序，以甘油為原料，獲得了高滴度的柚皮素（484 mg/l）、松脂素（198 mg/l），高滴度（55 mg/l，以咖啡酸酯為原 料）和后莫圣草素（17 mg/l）。在第二個例子中，使用基因庫和核糖體結(jié)合位點 （RBS）系統(tǒng)地操縱基因表達(dá)強度，用于十二醇生物生產(chǎn)。通過測試來自大腸桿菌 MG1655 的 60 株工程菌株，實施了兩個連續(xù)的 DBTL 循環(huán)以增強葡萄糖的產(chǎn)物形成。
在第一次迭代中，通過采用一組預(yù)測強度不同的 RBS 來調(diào)節(jié)不同酰基 載體蛋白（ACPs）/�；o酶 A（CoA）還原酶基因的表達(dá)。硫酯酶和酰基輔酶 A 合成酶基因同樣被納入這些設(shè)計中。接下來，將這些實驗中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)濃度和產(chǎn)品產(chǎn)量數(shù)據(jù)輸入機器學(xué)習(xí)算法，以預(yù)測進一步的優(yōu)化步驟�；谟嬎銠C預(yù)測 的第二次迭代使十二醇滴度（0.83±0.13 g/l）比第一次循環(huán)的基礎(chǔ)菌株提高了21%。重要的是，Opgenorth 及其同事的研究在實現(xiàn)機器學(xué)習(xí)算法提出的設(shè)計時暴露了缺點。挑戰(zhàn)包括（i）可用RBS對蛋白質(zhì)含量的可預(yù)測性有限，（ii）途徑 蛋白的非靶向效應(yīng)（例如 FadD �；�-輔酶 A 合成酶的表觀毒性），（iii）通過改變 單個 RBS（例如極性）帶來的整體操縱子效應(yīng)，（iv）當(dāng)使用密切相關(guān)（與完全 組合相反）構(gòu)造的訓(xùn)練集時，掩蓋整個數(shù)據(jù)空間中的局部趨勢，以及（iv）需要大數(shù)據(jù)集來可靠地訓(xùn)練機器學(xué)習(xí)路徑。
最近的另一項研究描述了一種半自動管道，用于優(yōu)化釀酒酵母工程菌株生產(chǎn)白樺酸（一種五環(huán)三萜）。作者應(yīng)用了 SCRaMbLE，這是一種體內(nèi)誘導(dǎo)的合成染色體缺失系統(tǒng)，目的是生成多樣化的菌株庫。白樺酸途徑模塊的設(shè)計和構(gòu)建階段 是手動進行的，而測試部分是通過實施自動化高通量篩選方法來執(zhí)行的。因此， 該文描述了使用酵母細(xì)胞工廠的全自動化生物生產(chǎn)過程的最接近的例子之一，有可能包含實現(xiàn)完全自動化的額外步驟。
另一種真菌物種假土曲霉（Aspergillus pseudoterus）已進行了深入的、多組學(xué)指導(dǎo)的工程，用于聚合物前體 3-羥基丙酸 （3-HPA）的糖依賴性生物合成——在生物反應(yīng)器培養(yǎng)物中，滴度可達(dá) 0.88±0.11 g/l。該方法基于蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)，鑒定能夠從預(yù)期的 3-HPA 合成途徑排出通量的上調(diào)蛋白。建立了合成β-丙氨酸依賴的產(chǎn)物形成途徑，并通過刪除負(fù)責(zé) 3-HPA 降解的丙二酸半醛脫氫酶基因（Apald6）重新定向乙酰輔酶 A 通量。
這個章節(jié)的討論提供了自動化潛力的原理示例。這些開創(chuàng)性的研究還揭示了一個事實，即大體上，模式生物是首選的生物鑄造宿主。只有將細(xì)菌宿主的種類大大擴展到大腸桿菌之外，特別是生產(chǎn)非普通化學(xué)品，生物鑄造廠的全部潛力才能實現(xiàn)。這項工作需要一個自動化的管道來實現(xiàn)非模型生物的合成工具集，同時需要組學(xué)驅(qū)動的對其代謝和生理學(xué)基礎(chǔ)知識的擴展。下一節(jié)將討論生物鑄造廠如何成為這方面的關(guān)鍵參與者。
05 通過自動化和擴展合成生物學(xué)工具箱為基于非傳統(tǒng)宿主的細(xì)胞工廠鋪平道路
體內(nèi) DNA 模塊的構(gòu)建和組裝以及從頭途徑設(shè)計是細(xì)胞工廠開發(fā)的重要組成部分。將這些技術(shù)推廣到非傳統(tǒng)宿主可以標(biāo)志著從緩慢馴化到合理設(shè)計的轉(zhuǎn)變， 克服復(fù)雜代謝網(wǎng)絡(luò)和有限的微生物生理學(xué)知識帶來的障礙。由于物種間的功能不相容性（例如，RecA 介導(dǎo)的重組較差），為生物技術(shù)主流的基因工程建立的方法很難轉(zhuǎn)移到非模型宿主。
最近為非模式生物量身定制了一些尖端技術(shù)，但仍有很大的改進空間——尤其是在準(zhǔn)確表征這些替代宿主中的工具方面。將非傳統(tǒng)微生物整合到生物鑄造管道中，不僅可以開發(fā)出新的（潛在的，更高級的）細(xì)胞工廠， 而且還將刺激對這些宿主的基礎(chǔ)研究。生物鑄造廠可以生產(chǎn)大量的表型和組學(xué)數(shù)據(jù)，如果這些數(shù)據(jù)被廣泛提供給科學(xué)界，將成為學(xué)術(shù)界和工業(yè)界研究的指導(dǎo)資源。對新分離的微生物及其工具箱進行表征，這項過去需要幾十年的努力，現(xiàn)在可以簡化并以很小的時間和成本進行。稍后將討論假單胞菌的基因組工程，以說明生物鑄造廠在實現(xiàn)這些目標(biāo)方面可能發(fā)揮的作用。
工具箱優(yōu)化和大規(guī)模復(fù)用是 DBTL 周期構(gòu)建階段的兩個重要方面，以釋放非傳統(tǒng)主機作為單元工廠的潛力。假單胞菌基因組工程已經(jīng)針對手動工作流程進 行了優(yōu)化，但它可以進一步發(fā)展為自動化設(shè)置。到目前為止，最快的惡臭假單胞菌基因缺失方案需要將自殺質(zhì)粒共整合到感興趣的位點中。
整合位點和要切除的區(qū)域由自殺質(zhì)粒中兩個同源臂（HA）的序列決定；用戶可以自由選擇這些臂來介導(dǎo)細(xì)菌染色體中幾乎任何位置的同源重組（HR）事件。通過在 HA 中加入遺傳元素，這些特征同樣可以整合到目標(biāo)基因座中。通過從輔助質(zhì)粒表達(dá)基因而反 式提供的 I-SceI 歸巢巨核酸酶引入雙鏈 DNA 斷裂，從而迫使第二個 HR 事件從基因組中移除質(zhì)粒骨架和靶區(qū)。通過將質(zhì)粒復(fù)制的合成控制納入所謂的 pQURE 質(zhì)粒工具集，這一策略得到了升級，通過向培養(yǎng)基中添加 3-甲基苯甲酸鹽，可以 嚴(yán)格控制質(zhì)粒的繁殖。然而，這些方法的潛力有待充分挖掘。例如，自動化可以用于在幾輪迭代中生成大型構(gòu)造庫。
為此，可以采用克隆標(biāo)準(zhǔn)，例如標(biāo)準(zhǔn)歐洲向量架構(gòu)（SEVA），以模塊化方式組裝復(fù)雜回路，從而產(chǎn)生與許多革蘭氏陰性宿主兼容的廣泛宿主范圍構(gòu)建體，同時促進遺傳部分的可重用性。在這里，作者提出了一個通過自動化和并行化相結(jié)合的非傳統(tǒng)革蘭氏陰性菌快速基因組工程的原型工作流（圖1B）。
該工作流程包括（i）遵循標(biāo)準(zhǔn)的模塊化 DNA 部分的平行和自動組裝、（ii）用組裝的構(gòu)建體對大腸桿菌進行電轉(zhuǎn)化，（iii）高通量純化質(zhì)粒 DNA 并用質(zhì)粒文庫轉(zhuǎn)化所需宿主，隨后（iv）用自固化 pQURE 載體轉(zhuǎn)化并對所得無質(zhì)粒菌株變體進行基因分型。該工作流程中的所有步驟都可以通過集成在機器人平臺中的自動液體處理器輕松控制。
雖然已知該工作流程中提到的所有技術(shù)都可單獨應(yīng)用于 P.putida，但需要對其他宿主中的功能元件和部件（例如抗生素標(biāo)記、基因表達(dá)系統(tǒng)、HR 機制和效率、轉(zhuǎn)化方案和反選擇標(biāo)記）進行快速和自動原型設(shè)計，以驗證其性能。可使用廣泛使用的技術(shù)（例如，USER 克隆、Golden Gate 克隆、Gibson 組裝或 SureVector） 組裝此類管道中使用的質(zhì)粒，并且根據(jù)所選擇的方法，自動化協(xié)議最近已經(jīng)可用。按照標(biāo)準(zhǔn)化的克隆策略，一旦創(chuàng)建了大多數(shù)部分，就可以重新用于多種構(gòu)建體——例如質(zhì)粒主干。鑒于整合質(zhì)粒中作為 HA 所需的特定 PCR 擴增子大小相等（約 500 bp），而不考慮靶點，這些 HA 可以以高通量方式獲得，例如 96 孔板（圖 1B 中的步驟 1）。
對于許多克隆策略，DNA 片段的組裝可以在相同的布局中進行， 甚至無需事先純化。一旦質(zhì)粒組裝好，它們就以 96 孔電穿孔板形式轉(zhuǎn)入大腸桿菌進行繁殖（圖 1B 中的步驟 2）。通過克隆 PCR 和 Sanger 測序驗證質(zhì)粒的正確 性。再次，使用標(biāo)準(zhǔn)化引物集進行驗證，這樣這一步驟也可以自動化。由于 Sanger 測序價格合理，克隆效率通常很高，這種方法既具有經(jīng)濟競爭力，又快速，因為不需要 DNA 純化或凝膠電泳，從而實現(xiàn)高通量。圖1B 中的步驟 3 說明了使用 市售 DNA 提取試劑盒以 96 孔板形式純化質(zhì)粒。
然后通過電穿孔、化學(xué)轉(zhuǎn)化或綴合將純化的質(zhì)粒引入感興趣的（非傳統(tǒng)）宿主中，回收后，將細(xì)胞接種到選擇性培養(yǎng)基上以選擇亞倍體。請注意，將細(xì)菌懸浮液分散到選擇性瓊脂平板上以分離單個菌落是序列中的關(guān)鍵步驟，但基本上沒有實現(xiàn)這一目的的全自動化、高效的方案。該方案的最后一部分（圖 1B 中的步驟 4）涉及通過在亞二倍體克隆中引入 pQURE 系統(tǒng)來強制第二次HR事件，然后進行質(zhì)粒固化。
可以使用陰性選擇標(biāo)記（例如，sacB）來促進質(zhì)粒消除，從而實現(xiàn)更高的產(chǎn)量。序列的最后一步是通過克隆 PCR 和 Sanger 測序進行基因型確認(rèn)，如質(zhì)粒構(gòu)建階段所示。此時， 菌株庫已準(zhǔn)備好進入測試階段，即多組學(xué)方法促進的代謝網(wǎng)絡(luò)分析。
06 引入以代謝為中心的分析作為發(fā)現(xiàn)平臺，指導(dǎo) DBTL 循環(huán)中的工程工作
采用非模式生物作為底盤的主要挑戰(zhàn)不僅是基因工程工具的相對缺乏—— 這可以通過實施上一節(jié)中建議的管道部分解決——而且關(guān)于代謝結(jié)構(gòu)及其調(diào)控的信息有限。因此，需要對不同環(huán)境條件下的代謝進行詳細(xì)分析，例如遺傳或化學(xué)干擾，以了解代謝結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)。反過來，這些信息可以用于確定與生物技術(shù)相關(guān)的可行代謝景觀。與自動化和合成生物學(xué)協(xié)同提高細(xì)胞工廠建設(shè)的速度和產(chǎn)量一樣，自動化與多組學(xué)分析相結(jié)合可以擴展對代謝網(wǎng)絡(luò)的知識。
在計算數(shù)據(jù)集成的支持下，用于系統(tǒng)生物學(xué)目的的多組學(xué)已經(jīng)取得了重大進展，這允許全面理解跨多組學(xué)層的代謝網(wǎng)絡(luò)。多種檢測和測量技術(shù)可用于捕獲基因型-表型之間的信息，包括 DNA 和 RNA 測序（即基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)）、基于質(zhì)譜（MS）的代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和通量組學(xué)以及核磁共振。圖 2 以加速基因組工程、多組學(xué)分析和自動化相結(jié)合的中心思想為基礎(chǔ)，為 DBTL 循環(huán)提供支持，同時解決微生物代謝的基本問題。
圖 2.以代謝為中心的合成生物學(xué)設(shè)計-構(gòu)建-測試-學(xué)習(xí)循環(huán)方法，由深度多組學(xué)分析支持。該圖從左至右描繪了在快速基因組工程、多組學(xué)分析和自動化支持下，在探索非傳統(tǒng)宿主代謝結(jié)構(gòu)的基本方面時指導(dǎo)工程步驟的一般策略。
這種類型的多組學(xué)分析體現(xiàn)在代謝中心觀點在不同微生物中的一些應(yīng)用中。不足為奇的是，其中兩個例子中采用了一種因其多功能和復(fù)雜的代謝而被廣泛認(rèn)可的非傳統(tǒng)宿主——P.putida。該文討論的實例包含了對（i）δ-戊內(nèi)酰胺（哌啶 -2-酮）作為唯一碳源的利用和ε-己內(nèi)酰胺（氮雜環(huán)己內(nèi)酰胺）的分解代謝，以 及（ii）復(fù)雜的脂肪酸和酒精代謝的多組學(xué)探索。
在第一個例子中，作者通過使用隨機條形碼轉(zhuǎn)座子測序（RB-TnSeq）和鳥槍蛋白質(zhì)組學(xué)的組合來研究δ-戊內(nèi)酰胺分解代謝，以提高內(nèi)酰胺滴度。一個特定位點（oplBA）被鑒定為編碼負(fù)責(zé)啟動δ-戊內(nèi)酰胺分解的功能。接下來，刪除 oplBA 基因以防止δ-戊內(nèi)酰胺在富培養(yǎng)基中降解，這也減少了ε-己內(nèi)酰胺的消耗。然后，使用關(guān)鍵代謝前體（即 L-賴氨酸或5-氨基戊酸）的途徑也被刪除，使得δ-戊內(nèi)酰胺滴度從檢測不到的顯著增加到約 90 mg/L。
在第二個例子中，RB-TnSeq 技術(shù)被用于為參與脂肪酸和酒精分解代謝的酶分配功能迄今其作用原理未知。通過序列同源性將功能分配給孤兒酶可能極具挑戰(zhàn)性，因為許多假定的旁系基因編碼相似的活性，可以共存，同時顯示不同的調(diào)控模式。在這種情況下，在對不同脂肪酸和醇作為唯一碳源的轉(zhuǎn)座子文庫進行深度適應(yīng)度分析后，強表型可追溯到數(shù)百個基因。根據(jù)在不同鏈長的脂肪酸上培養(yǎng)突變體池的實驗數(shù)據(jù)推斷酶底物偏好。一個特定的蛋白質(zhì)家族，稱為 DUF1302/DUF1329，被假設(shè)起酯酶的作用。此外，還發(fā)現(xiàn)了異戊醇（3-甲基丁烯-3-烯-1-醇，一種半萜醇）和異戊醇（3-乙基丁-1-醇）分解代謝的新途徑。
這些醇被提議在初始氧化步驟和通過 CoA 連接活化后通過 L-亮氨酸代謝分解。由于脂肪酸和醇都是生產(chǎn)重要生物產(chǎn)品的關(guān)鍵前體，這項研究的結(jié)果必將指導(dǎo)未來的菌株設(shè)計。
細(xì)胞工廠構(gòu)建過程中的代謝中心觀點也體現(xiàn)在腔色鏈球菌產(chǎn)生聚酮抗生素放線素的過程中。在這里，基于代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的分析表明，環(huán)腺苷酸 （cAMP）濃度與放線素生物合成密切相關(guān)，這似乎是一種調(diào)節(jié)性、多效性效應(yīng)， 而不是直接的前體喂養(yǎng)。
這一初步跡象導(dǎo)致作者在培養(yǎng)基中補充 cAMP。隨后的多組學(xué)分析表明，補充 cAMP 后，鳥嘌呤濃度增加。通過使用胍類似物7-甲基鳥 嘌呤抑制了胍依賴性反應(yīng)，這排除了 cAMP 的積極作用，表明同源反應(yīng)介導(dǎo)了細(xì)菌生長和抗生素生產(chǎn)的積極作用。
最后，通過自動化將細(xì)胞工廠建設(shè)推向下一個水平的以代謝為中心的方法可 以依賴于將細(xì)菌生長與感興趣分子的生物合成耦合，或?qū)⒆罱K促進生物質(zhì)形成的多個代謝模塊耦合。攜帶生長耦合模塊的菌株可以通過適應(yīng)性實驗室進化（ALE）進化，以改進表型豐富種群。這種方法將顯著減少篩選時間，因為識別高產(chǎn)量變體的參數(shù)是細(xì)菌生長。這種策略在構(gòu)建細(xì)胞工廠以生物合成難以生產(chǎn)的化合物時尤其有用，例如鹵化分子，這些化合物需要大量的分析工作來檢測和定量。
07 觀點總結(jié)和未來方向
生物鑄造廠是在生物工業(yè)的框架內(nèi)出現(xiàn)的，以加速細(xì)胞工廠的發(fā)展。優(yōu)化工作流程，為可持續(xù)化工生產(chǎn)建立高性能、工業(yè)級微生物平臺，是現(xiàn)有生物鑄造廠的座右銘，無論是在工業(yè)界還是學(xué)術(shù)界。
然而，利用生物鑄造廠的生產(chǎn)能力和概念框架 來獲得微生物生理學(xué)和代謝的基本知識，進而將這些信息反饋到工作流程中，以支持細(xì)胞工廠設(shè)計，這一潛力尚未得到開發(fā)。同樣，重新編程也為進一步深入了解生命系統(tǒng)的復(fù)雜性提供了基礎(chǔ)性的見解，為后續(xù)的工程設(shè)計提供了動力。
這一概念將有助于為生物技術(shù)和生物醫(yī)學(xué)重新編程細(xì)胞建立通用（而非生物特定）生物設(shè)計規(guī)則。
自動化是這些發(fā)展的關(guān)鍵，但并非沒有挑戰(zhàn)。為了使整個實驗室工作流程自動化，管道中實施的協(xié)議必須一致，提供精確的量化并確保再現(xiàn)性。盡管支持技術(shù)越來越可靠，但仍有很大的改進空間，因為在系統(tǒng)或多或少獨立運行之前，實現(xiàn)自動化例程仍然需要耗時的優(yōu)化。與這些努力相結(jié)合，多元組學(xué)分析也帶來了一些障礙。
很明顯，過去的學(xué)習(xí)在目標(biāo)分子和微生物宿主之間并沒有很好地傳遞， 而且實驗數(shù)據(jù)集的質(zhì)量、數(shù)量和一致性往往不足，無法從中學(xué)習(xí)，即使是大腸桿菌或酵母。因此，數(shù)據(jù)管理至關(guān)重要，因為深度和高通量分析會產(chǎn)生大量數(shù)據(jù)集。由于這些不一致性，多組分?jǐn)?shù)據(jù)集成相當(dāng)具有挑戰(zhàn)性，在開放獲取環(huán)境中跨生物鑄造廠的數(shù)據(jù)比較將至關(guān)重要。
幸運的是，已經(jīng)建立了一些計算工具以及統(tǒng)計工具箱來支持這些發(fā)展。如上述的一些示例所示，由于機器學(xué)習(xí)的預(yù)測能力，它也成為合成生物學(xué)的堅實支柱。
作者認(rèn)為，為該文所述目的調(diào)整生物鑄造廠可以以相對簡單的方式完成。在持續(xù)的嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒 2（SARS-CoV-2）大流行期間，生物鑄造廠的多功能性已成為一個明顯的例子，因為衛(wèi)生危機暴露了創(chuàng)新和快速適應(yīng)的生物技術(shù)方法對抵消其影響的重要性。迅速調(diào)整現(xiàn)有科學(xué)基礎(chǔ)設(shè)施和勞動力的用途， 從而開發(fā)出安全有效的候選疫苗。按照同樣的推理，可以預(yù)期，重新啟動生物鑄造廠以支持基本發(fā)現(xiàn)將擴大對非傳統(tǒng)微生物固有代謝復(fù)雜性的現(xiàn)有理解。
因此， 在 DBTL循環(huán)中應(yīng)用以代謝為中心的層將在未來通過生物合成途徑獲得化學(xué)物質(zhì)來升級工業(yè)生物技術(shù)，而到目前為止，這些化學(xué)物質(zhì)已超出常用細(xì)胞工廠的生物學(xué)范圍。盡管仍有一些挑戰(zhàn)有待解決（見未決問題），但該文中提出的一些解決方案可能有助于在急需替代石油生產(chǎn)（受到各種政治和經(jīng)濟影響）的時候鞏固生物經(jīng)濟。
08 未解決的問題
非傳統(tǒng)宿主中復(fù)雜（和有利）細(xì)胞性狀的生化和遺傳基礎(chǔ)是什么？
合成生物學(xué)能否實現(xiàn)這些特性的正向工程？
生物鑄造廠會根據(jù)預(yù)期應(yīng)用以及大量的底盤集來選擇最合適的宿主嗎？
自動化是否可以通過便利通常耗時的協(xié)議來推動處理代謝工程的方式的革命？
這些以代謝為中心的自動化序列在多大程度上有助于在實際工業(yè)規(guī)模上部署非傳統(tǒng)細(xì)胞工廠？
全文完
參考文獻：Gurdo N, Volke DC, Nikel PI. Merging automation and fundamental discovery into the design-build-test-learn cycle of nontraditional microbes. Trends in Biotechnology. 2022;40(10):1148-59.
Mediacenter Editor | 曼森編輯
文章來源：本文由中科院上海生命科學(xué)信息中心與曼森生物合作供稿
排版校對：劉娟娟編輯
內(nèi)容審核：郝玉有博士
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本公眾號跟蹤智慧實驗室的理論研究發(fā)展?fàn)顩r、產(chǎn)業(yè)發(fā)展動態(tài)、主要設(shè)備供應(yīng)商產(chǎn)品研發(fā)動態(tài)、國內(nèi)外智慧實驗室建設(shè)成果現(xiàn)狀等信息內(nèi)容。本文由中科院上海生命科學(xué)信息中心與曼森生物合作供稿。
本期推文編譯了 Gurdo N 等發(fā)表在 Trends in Biotechnology 期刊上的綜述《將自動化和基本發(fā)現(xiàn)融入非傳統(tǒng)微生物的設(shè)計-構(gòu)建-測試-學(xué)習(xí)循環(huán)》（Merging automation and fundamental discovery into the design-build-test-learn cycle of nontraditional microbes），該文作者提出了一種“以代謝為中心”的合成生物學(xué)設(shè)計-構(gòu)建-測試-學(xué)習(xí)循環(huán)的方法，并得到多組學(xué)分析的支持。
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