Vero細(xì)胞無血清懸浮培養(yǎng)技術(shù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)步驟

大多數(shù)用于抗體生產(chǎn)的細(xì)胞主要基于動(dòng)物細(xì)胞上的開發(fā)，如 MRC-5 人二倍體細(xì)胞、 Vero 猿猴腎上皮細(xì)胞、Madin-Darby 犬腎 (MDCK) 細(xì)胞和雞胚成纖維細(xì)胞 。尤其是來自非洲綠猴腎臟的 Vero 細(xì)胞已被廣泛用于vaccine生產(chǎn)，因?yàn)樗鼈儽籛HO機(jī)構(gòu)證明沒有致癌潛力。許多vaccine，例如針對(duì)基孔肯雅熱、登革熱、日本腦炎、病毒性胃腸炎、脊髓灰質(zhì)炎、狂犬病、羅斯河熱、嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥、天花、西尼羅河腦炎和流感的 vaccine都是使用 Vero 細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)開發(fā)的。

用于virus  vaccine生產(chǎn)的細(xì)胞依賴于貼壁，因此涉及這些細(xì)胞的過程不能輕易擴(kuò)大規(guī)模，因?yàn)樾枰�貼壁空間和胰蛋白酶消化。這導(dǎo)致了具有懸浮生長能力的永生和穩(wěn)定細(xì)胞系的發(fā)展.近期研究中，研究人員成功地在微載體上培養(yǎng)了 Vero 細(xì)胞，用于制備這些細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)物。實(shí)驗(yàn)表明，在沒有微載體的情況下培養(yǎng)的懸浮適應(yīng)性 Vero 細(xì)胞比貼壁 Vero 細(xì)胞產(chǎn)生更高量的 virus。

Vero 細(xì)胞培養(yǎng)使用動(dòng)物來源的成分較多，如血清、胰蛋白酶、乳清蛋白等。由于成本高和批次間差異，盡量使用血清。此外，牛血清的病毒、細(xì)菌和真菌、支原體污染也是細(xì)胞培養(yǎng)中的主要污染來源。因此，無血清細(xì)胞培養(yǎng)體系的優(yōu)化對(duì)于疫苗株的生產(chǎn)是必要的。  之前的研究中，在無血清 EX-Cell MDCK 中培養(yǎng)的 MDCK 細(xì)胞比在含血清的 Glasgow 低必需培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞產(chǎn)生更多的 virus。此外，還探索了在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng) Vero 細(xì)胞來生產(chǎn)許多virus  vaccine。

在這項(xiàng)研究中，我們?cè)噲D促進(jìn) Vero 細(xì)胞在振蕩懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)中的適應(yīng)性，并確定哪種培養(yǎng)基最適合在無血清的情況下培養(yǎng) Vero 細(xì)胞。與傳統(tǒng)的 Vero 細(xì)胞貼壁培養(yǎng)相比，Vero 細(xì)胞成功地適應(yīng)了懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)并產(chǎn)生了更多的 Adv。

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：
Vero 和 FRhk-4 細(xì)胞使用 10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中添加1u/mL的青霉素和 1 µg/mL 鏈霉素。培養(yǎng)條件為 5% CO₂含量，37℃。
MRC-5 細(xì)胞在含有 10% FBS 和 1 U/mL 青霉素和 1 µg/mL 鏈霉素的改良型 Eagle 培養(yǎng)基中。培養(yǎng)條件為 5% CO 2中， 37℃培養(yǎng)。
5 型 Adv (Ad5)  - GFP綠色熒光蛋白 。使用含有 2% FBS 的 DMEM 在 Vero 細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)染繁殖。

一、培養(yǎng)基的選擇性實(shí)驗(yàn)
OptiPRO SFM 和 VP-SFM 是無血清、超低蛋白培養(yǎng)基，不含蛋白質(zhì)、肽或其他動(dòng)物或人類來源的成分。
Gibco 的Opt-MEM 減血清培養(yǎng)基是一種改進(jìn)的 MEM，可以減少 FBS 的添加量。UltraCULTURE 培養(yǎng)基是一種無血清培養(yǎng)基，設(shè)計(jì)用于培養(yǎng)補(bǔ)充有重組人胰島素、牛轉(zhuǎn)鐵蛋白和牛血清蛋白（包括白蛋白）的純化混合物的哺乳動(dòng)物細(xì)胞類型。
SFM4MegaVir屬于一種無蛋白培養(yǎng)基，使用這種培養(yǎng)基的目的在于提高不含動(dòng)物來源成分的virus  vaccine生 產(chǎn)過程的產(chǎn)量。實(shí)驗(yàn)過程中需要 逐步降低 FBS 的百分比值，來適應(yīng)無血清培養(yǎng)條件。
我們主要在Optipro、UltraCULTURE、SFM4MegaVir、OptiMEM 和 VP-SFM這五種培養(yǎng)基中嘗試了細(xì)胞適應(yīng)。
1.細(xì)胞在 5% CO2 下培養(yǎng)2條件37℃。將細(xì)胞以1×10 ⁶ 個(gè)細(xì)胞/培養(yǎng)皿的濃度接種在細(xì)胞培養(yǎng)皿中。
2.在 37℃、5% CO 2條件下培養(yǎng) 72 小時(shí)后，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀和 0.4% 臺(tái)盼藍(lán)染色測(cè)定總細(xì)胞數(shù)，然后用 1×10 ⁶ 個(gè)細(xì)胞/盤，逐步減少常規(guī)培養(yǎng)基的百分比。
3.使用放大 100 倍的倒置相差顯微鏡根據(jù)細(xì)胞數(shù)量和形狀評(píng)估在培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞的形態(tài)。

二、Vero 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)
1.Vero 細(xì)胞在 250 mL 錐形瓶中在 5% CO 2條件置于二氧化碳振蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。貼壁細(xì)胞置于錐形瓶中，CO2搖床中，5% CO 2條件下，37℃培養(yǎng)5天；
2.使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器以及 0.4% 臺(tái)盼藍(lán)染色評(píng)估活細(xì)胞。
3.接下來，將粘附細(xì)胞以1.6×10 ⁵ 個(gè)細(xì)胞/m的密度添加到振蕩懸浮培養(yǎng)物中。連續(xù)培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)中的活細(xì)胞，并通過臺(tái)盼藍(lán)染色監(jiān)測(cè)其活力180天。

三、細(xì)胞轉(zhuǎn)染
Ad5  Adv包含在巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子控制下的 GFP 基因。用Vero細(xì)胞進(jìn)行Adv繁殖，然后用TCID 50滴定。為了比較粘附培養(yǎng)系統(tǒng)和懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)之間的Adv產(chǎn)量，將兩種類型的 Vero 細(xì)胞接種（以 1.3×10 ⁶ 個(gè)細(xì)胞/mL 的密度）在培養(yǎng)皿或錐形瓶中并孵育 5 小時(shí)。然后以0.1的感染復(fù)數(shù)感染細(xì)胞5天。通過使用熒光酶標(biāo)儀測(cè)量熒光強(qiáng)度來確定產(chǎn)生的 Ad5-GFP 的相對(duì)量并使用 GraphPad Prism ver.軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

四、統(tǒng)計(jì)分析
數(shù)據(jù)表示為平均值±平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。使用 GraphPad Prism ver. 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有 p 值均使用未配對(duì)的雙尾學(xué)生 t 檢驗(yàn) (α=0.05) 在 p<0.001 的顯著性水平上進(jìn)行評(píng)估。

五、Vero細(xì)胞無血清懸浮培養(yǎng)技術(shù)驗(yàn)證
為了研究Vero細(xì)胞是否可以在無血清條件下培養(yǎng)，對(duì)Vero細(xì)胞的形態(tài)變化和生長速率進(jìn)行了VP-SFM、Ultraculture、OptiPRO-SFM、Opti-MEM和SFM4MegaVir測(cè)試。在低血清培養(yǎng)條件下，在 OptiPRO、SFM4MegaVir 或 VP-SFM 中培養(yǎng)的 Vero 細(xì)胞表現(xiàn)出與在常規(guī)培養(yǎng)基（含 10% FBS 的 DMEM）中培養(yǎng)的 Vero 細(xì)胞相似的形態(tài)（圖 1A ）). 然而，在 Ultraculture 或 Opti-MEM 中培養(yǎng)的 Vero 細(xì)胞表現(xiàn)出異常形態(tài)，例如細(xì)胞聚集，這在常規(guī)培養(yǎng)條件下是觀察不到的。當(dāng)血清濃度從 10% 降低到 0% 時(shí)，OptiPRO 培養(yǎng)的 Vero 細(xì)胞在 0% FBS 的初始培養(yǎng)階段生長速率降低，但與常規(guī)培養(yǎng)條件（DMEM）相比，它們的生長速率增加并更高在 0% FBS 中培養(yǎng) 51 天后，含 10% FBS）（圖 1B）。然而，在 VP-SFM 或 SFM4MegaVir 培養(yǎng)基中培養(yǎng)的 Vero 細(xì)胞的生長速率低于在常規(guī)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的 Vero 細(xì)胞�？偟膩碚f，使用 OptiPRO 無血清培養(yǎng)基培養(yǎng) Vero 細(xì)胞時(shí)不會(huì)發(fā)生形態(tài)變化和生長速率下降。



 
圖 1
(A) 在無血清條件下生長的 Vero 細(xì)胞形態(tài)。藍(lán)色和紅色箭頭代表異常的細(xì)胞生長。(B) 與在含有 10% FBS 的 DMEM 中培養(yǎng)的細(xì)胞（對(duì)照；藍(lán)線）相比，在無血清條件下培養(yǎng)的細(xì)胞的生長速率。DMEM，Dulbecco 改良的 Eagles 培養(yǎng)基；FBS，胎牛血清。




對(duì)照組實(shí)驗(yàn)
我們測(cè)試了 Vero 細(xì)胞的無血清條件是否可以應(yīng)用于另一種疫苗株生產(chǎn)細(xì)胞系 MRC-5 和對(duì)照細(xì)胞，即 FRhk-4 細(xì)胞。與在常規(guī)培養(yǎng)基（含有 10% FBS 的 MEM）中培養(yǎng)的細(xì)胞相比，在 SFM4MegaVir Opti-Pro 或 VP-SFM 中培養(yǎng)的所有 MRC-5 細(xì)胞均顯示出異常的細(xì)胞形態(tài)，例如細(xì)胞縮短（圖 2A ）。在 Opti-MEM、SFM4MegaVir、Opti-Pro、VP-SFM 或 Ultraculture 中培養(yǎng)的 FRhk-4 細(xì)胞未顯示任何異常形態(tài)（圖 2C）). MRC-5 細(xì)胞在 VP-SFM 或 OptiPRO 無血清培養(yǎng)基中的生長速率低于在常規(guī)培養(yǎng)基（含 10% FBS 的 MEM）中培養(yǎng)的細(xì)胞，但在 Opti-MEM 或 Ultraculture 培養(yǎng)基中則不然。然而，由于細(xì)胞形態(tài)的變化，在 Opti-MEM 或 Ultraculture 中培養(yǎng)的 MRC-5 細(xì)胞在 8% FBS 下無法持續(xù)減少（圖 2B）。在 VP-SFM 或 Opti-MEM 中培養(yǎng)的 FRhk-4 細(xì)胞顯示出與在常規(guī)培養(yǎng)基中培養(yǎng)期間相似的生長速率（圖 2D）。

總之，在沒有 FBS 的情況下，Vero 細(xì)胞的適宜培養(yǎng)條件可能不適用于其他疫苗株生產(chǎn)細(xì)胞，例如 MRC-5 細(xì)胞。
   
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