壞死性凋亡的分子機(jī)制和在腫瘤免疫中的作用

   

細(xì)胞死亡可分為兩種模式：調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡 (RCD) 和意外細(xì)胞死亡 (ACD)。具有代表性的 RCD 是細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡 (apoptosis) 是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡 (見推文: 細(xì)胞凋亡——如何檢測？速戳!)，相反，非生理刺激，如物理、機(jī)械和化學(xué)應(yīng)力等外界因素誘導(dǎo)的被動和非程序性的壞死 (necrosis) 是 ACD 的代表。 

 

壞死性凋亡 (necroptosis) 綜合了兩者 (壞死和凋亡) 的特點(diǎn)，期間，可以觀察到細(xì)胞器腫脹、細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的分解等形態(tài)學(xué)變化，是一種受到調(diào)控的細(xì)胞壞死過程，又被稱為程序性壞死。

 

   
 

不同于凋亡過程，壞死性凋亡的調(diào)控過程不依賴于 Caspase 活性，其基本分子機(jī)制由兩種受體相互作用蛋白激酶 (RIPK1 和 RIPK3) 和混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣假激酶 (MLKL) 組成。RIPK3 調(diào)控 MLKL 磷酸化，誘導(dǎo)其寡聚化，易位至質(zhì)膜并在質(zhì)膜上產(chǎn)生孔復(fù)合體，導(dǎo)致 DAMPs (damage associated molecular patterns) 的分泌、細(xì)胞腫脹和膜破裂。

 

圖 1. 壞死性凋亡機(jī)制圖^[1]

 
   

研究認(rèn)為：腫瘤細(xì)胞發(fā)生壞死是為其增殖和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造有利環(huán)境的自我犧牲策略，但壞死性凋亡在大多數(shù)情況下發(fā)揮腫瘤抑制作用。2016 年，Aaes 等人首次確認(rèn)腫瘤中的壞死性凋亡是一種免疫原性細(xì)胞死亡。在 Vaccination with Necroptotic Cancer Cells Induces Efficient Anti-tumor Immunity 一文中，Aaes 等人將發(fā)生壞死性凋亡的腫瘤細(xì)胞制成預(yù)防性疫苗提前注射給小鼠，發(fā)現(xiàn)預(yù)防性疫苗的預(yù)處理抑制了小鼠的腫瘤生長，這表明發(fā)生壞死性凋亡的腫瘤細(xì)胞本身具有免疫原性，可刺激適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。Aaes 等人還指出，發(fā)生壞死性凋亡的腫瘤細(xì)胞可誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞的成熟、細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞的交叉啟動以及 IFN-γ 的產(chǎn)生。

 

 

2021 年 8 月 21 日，來自韓國的 You-Sun Kim 團(tuán)隊(duì)，在 Molecular Cancer 上發(fā)表了題為 RIPK3 activation induces TRIM28 derepression in cancer cells and enhances the anti-tumor microenvironment 的研究性論文，研究人員采用 TAP-MS 方法，結(jié)合 RNA 測序 (RNA-Seq) 數(shù)據(jù)集分析，確定了 TRIM28 是在壞死性凋亡過程中調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性的共抑制因子。活化的 RIPK3 磷酸化 TRIM28，抑制TRIM28 的染色質(zhì)結(jié)合活性，從而促進(jìn) NF-κB 和其他轉(zhuǎn)錄因子 (如 SOX9) 的反式激活。這些最終導(dǎo)致細(xì)胞因子表達(dá)升高，然后增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)過程，例如樹突狀細(xì)胞成熟等�？傊�，RIPK3 的表達(dá)與各種腫瘤類型的腫瘤浸潤性免疫細(xì)胞群呈顯著正相關(guān)，從而激活抗腫瘤免疫反應(yīng)。

 

 

圖 2. RIPK3/TRIM28 激活介導(dǎo)免疫刺激細(xì)胞因子的產(chǎn)生^[2]

 

 

2022 年 5 月 25 日，腫瘤免疫領(lǐng)域又有了關(guān)于壞死性凋亡的新發(fā)現(xiàn)。在 Nature 雜志發(fā)表的題為 ADAR1 masks the cancer immunotherapeutic promise of ZBP1-driven necroptosis 的論文中，研究指出，DNA 的右旋狀態(tài) (B-DNA)是生物體中存在的最常見的狀態(tài)，在特殊情況下，B-DNA 翻轉(zhuǎn)形成“畸形”的左旋狀態(tài)，即 Z-DNA。ADAR1 (RNA 腺苷脫氨酶1) 和 ZBP1 (Z-DNA 結(jié)合蛋白) 都可特異性識別 Z-DNA 并與之結(jié)合。ADAR1 通過抑制免疫原性雙鏈 RNA (dsRNA) 來阻斷免疫檢查點(diǎn)抑制劑 (ICB) 的作用，而 ZBP1 可驅(qū)動腫瘤細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡。

 

CBL0137 可觸發(fā)細(xì)胞中左旋 Z-DNA 的形成，激活癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞中的 ZBP1 依賴性壞死性凋亡途徑。CBL0137 在癌癥相關(guān)的成纖維細(xì)胞中誘導(dǎo) ZBP1 依賴的壞死性凋亡，并且無論導(dǎo)致癌癥的突變?nèi)绾�，CBL0137 都可殺死支持腫瘤生長的成纖維細(xì)胞，并在黑色素瘤的小鼠模型中逆轉(zhuǎn)了 ICB 的無反應(yīng)性。

 

圖 3. CBL0137 誘導(dǎo) ZBP1 依賴的壞死性凋亡^[4]

CBL0137 激活 ZBP1 依賴的細(xì)胞核壞死性凋亡：通過誘導(dǎo) Z-DNA 累積進(jìn)而觸發(fā)了 ZBP1、RIPK3 和 MLKL 之間的反應(yīng)。 

 

 

 

壞死性凋亡的檢測，關(guān)鍵的挑戰(zhàn)在于將它與凋亡和壞死區(qū)分開。很多情況下，凋亡、壞死、壞死性凋亡等不同的死亡方式會同時(shí)存在于細(xì)胞群中。因此，細(xì)胞死亡的檢測要輔以實(shí)時(shí)的形態(tài)分析以及死亡通路的抑制或敲除。同時(shí)，找對采樣的時(shí)間點(diǎn)也很關(guān)鍵。

 

■ 形態(tài)變化

細(xì)胞死亡的形態(tài)變化是一個(gè)動態(tài)變化的過程，因此，需要實(shí)時(shí)“監(jiān)控”整個(gè)過程才能確認(rèn)壞死性凋亡的發(fā)生。延時(shí)視頻顯微鏡能夠?qū)�單個(gè)細(xì)胞的形態(tài)變化與分子、亞細(xì)胞和生化事件相關(guān)聯(lián)，從而檢測壞死性凋亡 (但此方法成本較高且比較耗費(fèi)人力)。

 

■ 抑制和敲除

壞死性凋亡的抑制劑——RIPK1 抑制劑 Necrostatin-1 和 MLKL 抑制劑 Necrosulfonamide 來阻斷壞死性凋亡，測定細(xì)胞的存活率，反向驗(yàn)證壞死性凋亡的發(fā)生。但是抑制劑能在某些細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在區(qū)分壞死性凋亡和凋亡方面不夠特異。因此，需要通過敲除關(guān)鍵蛋白 (如 RIPK3 或 MLKL 阻斷壞死性凋亡)，補(bǔ)充抑制實(shí)驗(yàn)的證據(jù)。

 

■ 關(guān)鍵蛋白質(zhì)檢測

用 Western blot、免疫組化或流式細(xì)胞儀來檢測壞死性凋亡途徑中的關(guān)鍵蛋白質(zhì)如 RIPK3、RIPK1 和 MLKL 的變化。磷酸化 MLKL (Ser358 和 Thr357) 是最常見的檢測蛋白，可確認(rèn)壞死性凋亡是通過 RIPK3 介導(dǎo)的 MLKL 激活。此外，高比例的 RIPK1/ pro-caspase-8 的高比例也說明了環(huán)境有利于壞死性凋亡。

 

圖 4. 細(xì)胞死亡檢測一般流程^[5]

 

■ 關(guān)鍵蛋白質(zhì)檢測

在癌癥中，壞死性凋亡主要發(fā)生在晚期腫瘤的中心，壞死細(xì)胞分散。在不通過顯微解剖富集的情況下，很難檢測到關(guān)鍵蛋白標(biāo)記物。Baik 等人在 Examining MLKL phosphorylation to detect necroptosis in murine mammary tumors 一文提供了一種詳細(xì)的免疫組織化學(xué)導(dǎo)向的方法，包括從小鼠乳腺腫瘤模型中分離腫瘤、通過 H＆E 染色識別壞死區(qū)域以及檢測磷酸化 MLKL 來檢測壞死性凋亡；該方法也可用于其它類型的實(shí)體瘤。

 

圖 5. 檢測小鼠腫瘤組織的壞死性凋亡^[6]

 

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參考文獻(xiàn)

1. Galluzzi L, Kepp O, Chan FK, Kroemer G. Necroptosis: Mechanisms and Relevance to Disease. Annu Rev Pathol. 2017 Jan 24;12:103-130.

2. Aaes TL, Kaczmarek A, Delvaeye T, et al. Vaccination with Necroptotic Cancer Cells Induces Efficient Anti-tumor Immunity. Cell Rep. 2016 Apr 12;15(2):274-87.

3. Park HH, Kim HR, Park SY, et al. RIPK3 activation induces TRIM28 derepression in cancer cells and enhances the anti-tumor microenvironment. Mol Cancer. 2021 Aug 21;20(1):107.
4. Zhang T, Yin C, Fedorov A, et al. ADAR1 masks the cancer immunotherapeutic promise of ZBP1-driven necroptosis. Nature. 2022 Jun;606(7914):594-602.
5. ‍‍‍‍‍‍‍‍‍Chapter · February 2014. Methods to Study and Distinguish Necroptosis. DOI: 10.1007/978-1-4614-8220-8_18

6. Baik JY, Wan P, Liu ZG. Examining MLKL phosphorylation to detect necroptosis in murine mammary tumors. STAR Protoc. 2022 Jun 14;3(3):101457.