生物藥表征:翻譯后修飾脫酰胺

蛋白質(zhì)中天冬酰胺（Asn）和谷氨酰胺（Gln）殘基的非酶催化脫酰胺作為一種特殊的翻譯后修飾（PTM）在體內(nèi)或體外時有發(fā)生，可影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性、折疊和聚集等。特別是已知單克隆抗體分子內(nèi)某些位置的脫酰胺會影響產(chǎn)品的安全性和有效性，因此通常被視為關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQA）。同時，在衰老、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、年齡相關(guān)疾病和自身免疫性疾病中，蛋白質(zhì)脫酰胺化均起著重要的作用。

 

1.脫酰胺反應(yīng)過程

 

以天冬酰胺為例，Asn的脫酰胺反應(yīng)通過琥珀酰亞胺中間體進行，該中間體在主鏈氮（在C端側(cè)）攻擊天冬酰胺的側(cè)鏈羧基時形成。琥珀酰亞胺在中性和堿性條件下很容易水解產(chǎn)生Asp或isoAsp（β-Asp），其中isoAsp產(chǎn)物以約3:1的比例優(yōu)先。

 

脫酰胺有兩個相互關(guān)聯(lián)的類型：異構(gòu)化和外消旋化。異構(gòu)化是指Asp轉(zhuǎn)化為具有延伸肽主鏈的isoAsp，但從Asp形成中間產(chǎn)物的速度明顯較慢。外消旋是指L-琥珀酰亞胺外消旋為D-琥珀酰亞胺，水解后的產(chǎn)物為D-Asp和D-IsoAsp，因此脫酰胺后可能有四種產(chǎn)物，即L-Asp、L-IsoAsp、D-Asp、D-IsoAsp。
 

圖丨脫酰胺反應(yīng)過程

 

2.脫酰胺反應(yīng)的影響因素

 

蛋白質(zhì)的脫酰胺不但與自身結(jié)構(gòu)有關(guān)，也與相應(yīng)的環(huán)境相關(guān)，如pH、溫度、鹽離子濃度等。

1） pH值 脫酰胺反應(yīng)中，堿性條件有利于中間體琥珀酰亞胺的生成。文獻報道，隨著pH從5.3增加到8.3，IgG1脫酰胺速率總體上也在增加。

2） 溫度 據(jù)報道，隨著溫度的升高，脫酰胺速率增加，但是緩沖液類型在溫度對脫酰胺的影響中起著很重要的作用。文獻發(fā)現(xiàn)，在40℃下，磷酸鈉緩沖液中的Fc脫酰胺速率比Tri-Hcl緩沖液更快，然而在5℃下，這一趨勢發(fā)生逆轉(zhuǎn)，與磷酸鈉相比，Tris HCl中的Fc脫酰胺速度更快[1]。

3） 緩沖液 緩沖液對脫酰胺速率的影響可能由于溶液中的OH-的影響，因為解離常數(shù)pKa也是隨著溫度的變化而變化的。

4） 蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu) 脫酰胺速率取決于相鄰氨基酸殘基的大小，較小的氨基酸殘基減少了初始環(huán)化反應(yīng)的空間位阻及其作為氫鍵供體的側(cè)鏈可用性（可能是由于Asn的羰基氧的分子內(nèi)氫鍵），使其更親電，從而對親核攻擊更具反應(yīng)性。因此，甘氨酸是促進脫酰胺作用最有利的氨基酸，其次是絲氨酸，而脯氨酸是最不利脫酰胺反應(yīng)的氨基酸殘基。

5） 蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu) 脫酰胺作用不僅取決于蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)，還取決于其三維結(jié)構(gòu)。文獻報告，在IgG1中，七個Asn殘基中只有兩個（Asn54和Asn56）對脫酰胺反應(yīng)敏感，這種差異是由于連續(xù)殘基的構(gòu)象動力學(xué)導(dǎo)致的[2]。另外抗原-抗體復(fù)合物的脫酰胺反應(yīng)不會導(dǎo)致異天冬氨酸的形成，這表明抗原-抗體復(fù)合物可防止來自特定方向的水的攻擊，這很可能是由于抗原與抗體結(jié)合時的空間位阻或局部構(gòu)象變化[3]。

 

3.脫酰胺反應(yīng)的表征方法

 

脫酰胺產(chǎn)物的表征是復(fù)雜的，因為該反應(yīng)產(chǎn)生四種不同的Asp異構(gòu)體，包括L-Asp和L-isoAsp以及不太常見的D-Asp、D-IsoAsp。所有脫酰胺產(chǎn)物都給蛋白質(zhì)帶來負(fù)電荷，每個異構(gòu)體以不同的方式影響結(jié)構(gòu)和功能。

 

脫酰胺表征的方法有很多，如下表所示，不同方法各有優(yōu)缺點。IEF基于等電點分離，因此仍然是鑒定脫酰胺作用的常用技術(shù)。然而，它的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確性較低。CZE、CE和IEX-HPLC根據(jù)電荷異質(zhì)性分離脫酰胺產(chǎn)物，而RP-HPLC根據(jù)疏水性或極性變化分離。CE和HPLC的主要局限性是靈敏度低和檢測限高（即約為總蛋白質(zhì)的1%），但它通常用于制藥行業(yè)的常規(guī)質(zhì)量控制。

 

基于質(zhì)譜的分析（LC-MS或LC-MS/MS）具有更高的靈敏度，是檢測PTM的“金標(biāo)準(zhǔn)”。脫酰胺反應(yīng)導(dǎo)致質(zhì)量增加約+1 Da，這很容易通過靈敏的MS方法檢測到。但是質(zhì)譜的樣品前處理過程很可能引入人為脫酰胺反應(yīng)，因此在前處理過程中需優(yōu)化條件，減少樣品在實驗過程中發(fā)生脫酰胺反應(yīng)導(dǎo)致的假陽性。文獻報道，曲妥珠單抗血漿樣品在37°C、pH 7條件下消化三小時，消化效率合理（>80%），并且消化過程中形成的脫酰胺產(chǎn)物最少（<1%）[4]。

 

表:脫酰胺表征方法對比[5]

 

4.脫酰胺對穩(wěn)定性、活性、免疫原性的影響

 

脫酰胺可改變抗體的結(jié)構(gòu)和功能，從而影響穩(wěn)定性、活性和免疫原性。由于殘基電荷從中性變?yōu)樨?fù)，脫酰胺反應(yīng)最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)等電點（pI）降低，這種降解反應(yīng)導(dǎo)致蛋白質(zhì)產(chǎn)物中的電荷異質(zhì)性。脫酰胺反應(yīng)使得產(chǎn)品中存在脫酰胺和非脫酰胺的混合物，這種脫酰胺變體通常被稱為酸性蛋白變體。已經(jīng)證明，電荷異質(zhì)性可以通過影響FcRn-IgG離解來改變單克隆抗體的藥代動力學(xué)（PK）。此外，酸性電荷變體影響單克隆抗體的抗增殖活性和穩(wěn)定性。

 

脫酰胺反應(yīng)對活性的影響與其在蛋白質(zhì)中的位置有關(guān)，如Fc區(qū)的脫酰胺作用主要發(fā)生在恒定區(qū)，即Asn389和Asn434，并不影響FcγR和FcRn的結(jié)合[6]。研究表明，互補決定區(qū)（CDR）中的脫酰胺作用會影響單克隆抗體與抗原的結(jié)合特異性和親和力。CDR區(qū)域外的脫酰胺可能不會影響藥物產(chǎn)品的活性或效力，但會降低CDR區(qū)域的結(jié)合親和力和效力。Qiu等人[7]設(shè)計了人抗CD52 IgG1，用Asp殘基取代Asn33，模擬脫酰胺產(chǎn)物，并發(fā)現(xiàn)抗原結(jié)合親和力降低400倍。

 

脫酰胺也可能導(dǎo)致產(chǎn)品免疫原性的差異。一項研究[8]對比了含有脫酰胺肽段和含有琥珀酰亞胺肽段的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）反應(yīng)，結(jié)果表明，當(dāng)兩種肽段通過主要組織相容性復(fù)合體（MHC）呈遞時，幾乎沒有交叉反應(yīng)，這說明脫酰胺形式的蛋白質(zhì)可能具有不同的免疫原性，這對疫苗設(shè)計、生物制藥穩(wěn)定性和儲存都具有明顯的影響。

 

抗體的脫酰胺反應(yīng)在制造和儲存期間是一種常見且難以控制的翻譯后修飾，了解脫酰胺的反應(yīng)過程、影響因素，在藥物的制造、配方、儲存、生產(chǎn)后和給藥過程中進行表征監(jiān)控，繼而采用各種緩解策略降低其對活性的影響，是藥物生產(chǎn)中重要的一環(huán)。