高通量化合物篩選技術(shù)加速抗猴痘病毒早期藥物開(kāi)發(fā)

猴痘是一種病毒性人畜共患病，是由于感染猴痘病毒 (Monkeypox virus) 而致，近期猴痘病毒在非洲及以外多個(gè)國(guó)家出現(xiàn)，且數(shù)量還在增加，并出現(xiàn)了人際傳播，備受科學(xué)家關(guān)注。 

猴痘病毒屬于痘病毒科—脊椎動(dòng)物痘病毒亞科下的一個(gè)屬，被稱(chēng)為正痘病毒屬。正痘病毒屬包括多種不同類(lèi)別的病毒，我們比較熟知的天花病毒就是其中一種。

 

正痘病毒屬內(nèi)的所有病毒都可產(chǎn)生交叉免疫反應(yīng)，這意味著一種病毒感染時(shí)產(chǎn)生的細(xì)胞毒性 T 淋巴細(xì)胞和產(chǎn)生抗體的 B 淋巴細(xì)胞可以防止該屬其他病毒的感染，這也是天花疫苗可以對(duì)猴痘病毒產(chǎn)生 85% 保護(hù)力的原因。  

正痘病毒是一種雙鏈 DNA 病毒，個(gè)頭較大，結(jié)構(gòu)相對(duì)復(fù)雜。病毒最外面被外膜包圍，呈磚形，病毒粒子內(nèi)部有一個(gè)啞鈴型的核心，主要成分是病毒的基因組雙鏈 DNA，以及多種 (至少 20 種以上) 病毒增殖相關(guān)的酶。病毒核心由一層膜包圍，啞鈴核心與外膜之間的區(qū)域稱(chēng)為側(cè)體 (lareral body)。

 

正痘病毒有兩種感染模式：成熟病毒粒子 (mature virion，MV) 有單一的脂膜包裹著一個(gè)啞鈴狀的核心，是一種基本的感染形態(tài)，此外，痘病毒還有一種形態(tài)，也就是成熟病毒粒子外還包圍有一層額外的脂質(zhì)膜 (extracellular enveloped，EV)。兩種病毒粒子內(nèi)部結(jié)構(gòu)相同，但由于包膜表面內(nèi)嵌有不同的表面蛋白，因此侵入機(jī)制略有不同。

 

圖 1 . 痘病毒結(jié)構(gòu)示意圖^[1]

病毒感染機(jī)制大概模式基本類(lèi)似，即附著于宿主細(xì)胞表面——進(jìn)入宿主細(xì)胞 (通過(guò)內(nèi)吞、膜融合或二者同時(shí)) ——脫殼 (即病毒基因組釋放) ——病毒基因組復(fù)制——病毒蛋白合成、加工及組裝——新組裝病毒釋放。痘病毒的 2 種感染機(jī)制，下面做一下詳細(xì)講解

圖 2. 痘病毒復(fù)制周期^[3]

 

■ 1. 附著、入胞

前面講過(guò)正痘病毒有兩種病毒粒子：成熟病毒粒子 (MV) 和包膜病毒粒子 (EV)。由于EV 相比 MV 外面多一層膜，所以附著機(jī)制也有一定區(qū)別。

 

對(duì)于成熟病毒粒子 MV，通過(guò)病毒表面膜蛋白與宿主細(xì)胞表面蛋白結(jié)合而附著于宿主細(xì)胞表面。而包膜病毒粒子 EV，最外層包膜上面的蛋白與細(xì)胞結(jié)合后，可以導(dǎo)致最外層包膜降解，成為和 MV 一樣的結(jié)構(gòu)，然后通過(guò)與 MV 一樣的機(jī)制附著于細(xì)胞表面。

 

病毒附著于細(xì)胞后，病毒包膜與細(xì)胞膜融合，在細(xì)胞膜上形式成一個(gè)孔，含病毒 dsDNA 的核心通過(guò)這個(gè)孔進(jìn)入到細(xì)胞中。

 

■ 2. 脫殼

病毒粒子核心進(jìn)入宿主細(xì)胞后，通過(guò)微管深入到細(xì)胞核外的一個(gè)離散位置，將病毒基因組釋放出來(lái)，并在這里建立 “病毒工廠”，進(jìn)行病毒基因組的復(fù)制，轉(zhuǎn)錄及組裝。

 

■ 3. 轉(zhuǎn)錄、翻譯

 

正痘病毒不需要進(jìn)入細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)制，因?yàn)閱��?dòng)轉(zhuǎn)錄和處理病毒 mRNA 所需的所有酶都隨病毒粒子核心攜帶進(jìn)入細(xì)胞中 (自理能力很強(qiáng))。由于正痘病毒的 DNA 復(fù)制發(fā)生在基因早期轉(zhuǎn)錄和翻譯之后，所以我們先簡(jiǎn)單說(shuō)下轉(zhuǎn)錄翻譯: 正痘病毒的轉(zhuǎn)錄是以級(jí)聯(lián)的方式進(jìn)行，即早期轉(zhuǎn)錄翻譯所編碼的蛋白用于 DNA 復(fù)制及中期基因組轉(zhuǎn)錄，而中期轉(zhuǎn)錄翻譯所編碼的蛋白可以用于后期基因表達(dá)。

 

正痘病毒的一個(gè)很大特點(diǎn)就是會(huì)編碼大量蛋白，一些蛋白通過(guò)中和干擾素和細(xì)胞因子、抑制凋亡和干擾細(xì)胞抗病毒信號(hào)通路等方式參與多種免疫逃逸反應(yīng)。并且這些蛋白會(huì)包裝在新的病毒粒子里面，在感染過(guò)程中被運(yùn)送至其他細(xì)胞中。

 

■ 4. DNA 復(fù)制

正痘病毒 DNA 復(fù)制也是一個(gè)很有意思的地方。前面講過(guò)，痘病毒 DNA 的復(fù)制是在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行的，和其他很多病毒不一樣。正痘病毒在早期基因轉(zhuǎn)錄和翻譯后立即開(kāi)始 DNA復(fù)制。具體過(guò)程見(jiàn)下圖：

 

圖 3. 正痘病毒復(fù)制過(guò)程^[2]

 

■ 5. 病毒組裝、成熟和釋放

病毒工廠，首先形成月牙膜，并招募基因組DNA和核心蛋白，形成球形的未成熟病毒粒子。在側(cè)體相關(guān)的病毒蛋白酶作用下，病毒粒子成熟，在細(xì)胞裂解時(shí)被釋放出來(lái)，即 MV 形成。

當(dāng) MV 通過(guò)高爾基復(fù)合體或胞內(nèi)體時(shí)，形成了被雙層膜包圍的MV即wrapped virion，wrapped virion通過(guò)胞吐作用被釋放出細(xì)胞時(shí)，最外層膜與細(xì)胞膜融合，形成含單層膜包圍的 MV，即 EV。EV 主要與細(xì)胞間擴(kuò)散有關(guān)，而 MV 主要是與宿主的感染有關(guān)。

 

 

目前還沒(méi)有專(zhuān)門(mén)針對(duì)猴痘病毒的藥物。前面提到，由于正痘病毒之間可以產(chǎn)生交叉免疫反應(yīng)，所以天花疫苗可以對(duì)猴痘病毒產(chǎn)生保護(hù)力。JYNNEO^TM (Imvanex) 疫苗已經(jīng)在美國(guó)批準(zhǔn)用于猴痘預(yù)防。但還沒(méi)有用于猴痘治療的小分子藥物，但根據(jù)體外及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，Cidofovir、Brincidofovir (CMX001) 及 Tecovirimat (ST-246) 對(duì)正痘病毒具有較好的活性，美國(guó) CDC 表示，以上藥物可以用于預(yù)防猴痘的爆發(fā)。

 

同時(shí)基于其他抗病毒藥物的開(kāi)發(fā)經(jīng)驗(yàn)，可以通過(guò)干擾病毒生命周期的關(guān)鍵調(diào)控蛋白達(dá)到抑制病毒增殖的目的，進(jìn)行藥物開(kāi)發(fā)。

 

■ 現(xiàn)有抗病毒藥物

抗病毒藥物比較常用的靶點(diǎn)包括病毒膜表面蛋白、宿主細(xì)胞受體、調(diào)控膜融合的關(guān)鍵蛋白、DNA 復(fù)制關(guān)鍵酶 (如 DNA 聚合酶、蛋白合成關(guān)鍵酶，如 RNA 聚合酶，及病毒粒子包裝釋放相關(guān)蛋白等)。因?yàn)椴煌�病毒生命周期中關(guān)鍵調(diào)控蛋白不同，具體靶點(diǎn)還需要對(duì)該病毒具體感染機(jī)制進(jìn)行深入研究。

 

但部分靶點(diǎn)在不同病毒之間可以通用，比如 DNA 聚合酶，RNA 聚合酶等。所以靶向這類(lèi)靶點(diǎn)的抗病毒藥物會(huì)具有一定廣譜性。如上述 Cidofovir 通過(guò)抑制病毒 DNA 聚合酶活性以控制巨細(xì)胞病毒 CMV 復(fù)制，該藥物對(duì)多種正痘病毒也有較高的抑制活性。此外核苷類(lèi)化合物，可以模擬機(jī)體內(nèi)核苷及核苷酸，參與 DNA 或 RNA 合成，阻斷核酸復(fù)制，是常見(jiàn)的廣譜抗病毒藥物。

 

白色: 表示痘苗病毒復(fù)制的主要階段。黃色: 干擾復(fù)制的每一步的代表性化合物。

細(xì)胞外包膜病毒粒子(EEV)，細(xì)胞內(nèi)成熟病毒粒子(IMV)，不成熟病毒粒子(IV)，細(xì)胞內(nèi)包膜病毒粒子(IEV)和細(xì)胞相關(guān)包膜病毒粒子(CEV)。

  

■ 高通量篩選可用于抗病毒藥物開(kāi)發(fā)

上面已經(jīng)說(shuō)到，部分靶點(diǎn)在病毒之間可以通用，此外不同的病毒感染機(jī)制不完全一樣，但感染的模式基本相同。從已經(jīng)報(bào)道具有抗病毒活性的化合物或藥物中篩選抗正痘病毒藥物，會(huì)大大提高篩選命中率，加快藥物開(kāi)發(fā)的速度。尤其針對(duì)發(fā)生率不高，市場(chǎng)潛力不大但需求迫切的抗病毒藥物來(lái)說(shuō)，從現(xiàn)有的抗病毒藥物中開(kāi)發(fā)新適應(yīng)癥，開(kāi)發(fā)成本低，研發(fā)速度快，是一種不錯(cuò)的的解決方案。

 

高通量篩選技術(shù)一直是早期藥物開(kāi)發(fā)的重要重要篩選方式。MCE 可以提供 100+不同的化合物庫(kù)，涵蓋 15000+活性化合物，是先導(dǎo)化合物開(kāi)發(fā)的重要來(lái)源。相關(guān)抗病毒化合物庫(kù)推薦：

 

相關(guān)抗病毒化合物庫(kù)推薦

抗病毒化合物庫(kù) 650+ 種抗病毒化合物集合，對(duì)多種病毒有效，是開(kāi)發(fā)抗病毒藥物的有效工具。

核苷類(lèi)化合物庫(kù) 包含 260+ 種核苷酸類(lèi)化合物，包括核苷酸、核苷及其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，是開(kāi)發(fā)抗病毒藥物的有效工具。

抗 COVID-19 化合物庫(kù) 基于多種 COVID-19 病毒關(guān)鍵靶點(diǎn)，利用虛擬篩選技術(shù)， 對(duì) MCE 已有的老藥新用化合物庫(kù)進(jìn)行虛擬篩選，匯總整理出 1500+ 種具有潛在抗新型冠狀病毒活性的化合物，是篩選抗新型冠狀病毒藥物的有力工具。

抗丙型肝炎病毒化合物庫(kù) 200+ 種具有明確及潛在抗 HCV 活性的化合物，是開(kāi)發(fā)新的抗 HCV 藥物及抗感染研究的有用工具。

抗正痘病毒活性化合物推薦

Cidofovir Cidofovir 可通過(guò)抑制病毒 DNA 聚合酶活性以控制巨細(xì)胞病毒 CMV 復(fù)制。對(duì)多種正痘病毒有活性。

Brincidofovir Brincidofovir (CMX001) 是 Cidofovir 的脂質(zhì)結(jié)合前體藥物，是一種口服、長(zhǎng)效抗病毒藥物。Brincidofovir 對(duì)廣泛的 DNA 病毒具有活性，包括巨細(xì)胞病毒 (CMV)、腺病毒 (ADV)、水痘帶狀皰疹病毒、單純皰疹病毒、多瘤病毒、乳頭瘤病毒、痘病毒和混合雙鏈 DNA 病毒感染。

‍Mitoxantrone Mitoxantrone 是拓?fù)洚悩?gòu)酶 II (topoisomerase II) 的抑制劑；也可抑制蛋白激酶 C (PKC)，IC50 值為8.5 μM。

MCE 的所有產(chǎn)品僅用作科學(xué)研究或藥證申報(bào)，我們不為任何個(gè)人用途提供產(chǎn)品和服務(wù)。

 

 

 

參考文獻(xiàn)

1.  Jennifer Louten, Chapter 15 - Poxviruses, Editor(s): Jennifer Louten, Essential Human Virology, Academic Press, 2016, Pages 273-290, ISBN 9780128009475

2.  Moss B. Poxvirus DNA replication. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2013 Sep 1;5(9):a010199.

3.  McFadden G. Poxvirus tropism. Nat Rev Microbiol. 2005 Mar;3(3):201-13.

4.  Prichard MN, Kern ER. Orthopoxvirus targets for the development of antiviral therapies. Curr Drug Targets Infect Disord. 2005 Mar;5(1):17-28.