單一/混合蛋白質(zhì)分離純化方法與質(zhì)譜鑒定詳解

瀏覽次數(shù)：508　發(fā)布日期：2023-3-9　來源：百泰派克生物科技-原創(chuàng)

文章導讀

• 單一蛋白質(zhì)樣品的分離、純化？
• 單一蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定？
• 蛋白質(zhì)混合物質(zhì)譜鑒定方法？

對于單一蛋白的常用鑒定方法，大家肯定立馬想到免疫印跡法（Western Blot）。Western Blot是通過抗體和目標分子的特異性結(jié)合從而對目標蛋白進行鑒定，但是這種方法是適用于對已知蛋白進行鑒定，并且必須借助抗體，所以不適用于對未知或者沒有相應抗體的蛋白進行分析。那么小伙伴們可能要問了，如果自己要研究的蛋白質(zhì)是未知的或者目前沒有可用抗體怎么辦呢？在這種情況下，就可以借助質(zhì)譜鑒定技術(shù)來對蛋白質(zhì)進行鑒定了。在這期中小編就給大家整理了蛋白質(zhì)鑒定的相關(guān)知識，希望對于蛋白質(zhì)鑒定一直有困惑的同學能有幫助。

一、單一蛋白質(zhì)分離純化

提到單一蛋白樣品，顧名思義在這類蛋白樣品應該已經(jīng)經(jīng)過了一定的蛋白純化步驟，獲得了相對單一的蛋白。通常通過細胞裂解或者體外合成的蛋白質(zhì)都包含其他的雜蛋白，因此需要將目的蛋白與雜蛋白區(qū)分開，常用的蛋白分離純化方法便是電泳分離。一維電泳分離利用蛋白質(zhì)大小不同的特性，能夠很好的將不同分子量的蛋白進行區(qū)分，另外，再次基礎(chǔ)之上二維電泳能夠進一步將不同帶點量的蛋白分子進行區(qū)分。

1. 一維電泳
目前普遍采用的一維電泳為垂直板聚乙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE膠），其原理是不同濃度的乙烯酰胺在聚合后會產(chǎn)生具有一定孔徑大小的凝膠，接著在緩沖液中加入SDS表面活性劑中和蛋白質(zhì)表面的電荷，當變性的蛋白質(zhì)混合樣品通過凝膠空隙的時候，不同分子量大小的蛋白質(zhì)在凝膠中遷移的速度不同因而被分離開來。一維電泳能夠分離對大多數(shù)蛋白和蛋白質(zhì)復合物進行初步分離。

Western Blot是通過抗體和目標分子的特異性結(jié)合從而對目標蛋白進行鑒定，但是這種方法不適用于對未知或者沒有相應抗體的蛋白進行分析。在這期中小編就給大家整理了蛋白質(zhì)鑒定的相關(guān)知識，希望對于蛋白質(zhì)鑒定一直有困惑的同學能有幫助。

圖1. 蛋白質(zhì)一維電泳分離

2. 二維電泳
二維電泳，也稱為雙向電泳，是在一維電泳的基礎(chǔ)上加入了橫向的等電聚焦分離，而其縱向的分離與一維SDS分離方法完全一樣。二維電泳首先利用蛋白等電點不同的特性，對蛋白進行初步分離，接著再根據(jù)蛋白質(zhì)分子量不同，再進一步對等電點相同或相近的蛋白質(zhì)進行二維分離，進一步提升蛋白質(zhì)分離效率。二維電泳的蛋白分辨率相比一維電泳已經(jīng)大幅度提升，經(jīng)過二維電泳分離后大部分蛋白質(zhì)都能夠被分離為含有單一的蛋白質(zhì)蛋白膠點。

圖2. 蛋白質(zhì)二維電泳分離

二、單一蛋白質(zhì)鑒定

目前對純度較高，或單一蛋白質(zhì)的鑒定的方法有蛋白質(zhì)指紋譜鑒定（PMF）和MS/MS串聯(lián)質(zhì)譜鑒定法。這兩種方法都是先將蛋白質(zhì)酶切成多肽片段，再利用質(zhì)譜儀對肽段分析，達到對蛋白質(zhì)鑒定的目的。而兩種方法的不同之處就在于PMF法只使用一級質(zhì)譜對蛋白肽段進行檢測，而MS/MS不僅經(jīng)過一級質(zhì)譜檢測，并且在此基礎(chǔ)上選取特定肽段進行肽段破碎，對肽段的序列進行測定。因此MS/MS比PMF的鑒定準確度更高，與數(shù)據(jù)庫比對的可靠性更高，但分析起來的也更為復雜。

1. 蛋白質(zhì)指紋譜鑒定（PMF）
由于蛋白質(zhì)序列的不同，因此不同的蛋白質(zhì)在同一種消化酶的作用下酶切產(chǎn)生的多肽片段大小質(zhì)量是特異的。蛋白質(zhì)指紋譜鑒定法正是利用了每種蛋白酶切產(chǎn)生的太片段不同的特性，對純化的蛋白質(zhì)進行酶切處理，再對酶切產(chǎn)生的肽片段的質(zhì)量進行分析，即可獲得蛋白質(zhì)的肽質(zhì)量譜圖。再將肽譜圖與數(shù)據(jù)庫中蛋白質(zhì)理論肽譜圖進行比對，進而可獲知蛋白質(zhì)的身份信息。

2. MS/MS串聯(lián)質(zhì)譜法
串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）檢測蛋白的原理是先使用一級質(zhì)譜檢測肽段的質(zhì)量信息，再選取峰值高的肽段進行破碎，分析獲得二級質(zhì)譜。用檢索軟件選擇相應的數(shù)據(jù)庫對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行分析，同時以打分的形式評判鑒定結(jié)果，當打分大于某個閾值時，即判定質(zhì)譜鑒定成功，反之則鑒定失敗。

三、蛋白混合物鑒定

雖然目前有多種蛋白質(zhì)分離純化的方法，但在很多時候分離效率不夠高，導致分離后的蛋白可能還是含有多個蛋白。另外，對于豐度較低的蛋白質(zhì)可能在分離過程中造成進一步損失而無法被鑒定到，因此需要直接對這一類蛋白質(zhì)不經(jīng)過分離處理直接進行分析。目前適用于對混合蛋白進行分析的方法有LC-MS/MS色譜質(zhì)譜串聯(lián)分析法。與PMF法和MS/MS法相比，LC-MS/MS在質(zhì)譜分析前加了液相色譜的分離，使得蛋白分析精度更高，對肽段序列測定幾乎可以的達到100％的準確度。因此，與單個蛋白質(zhì)膠帶的鑒定相比，這項服務(wù)的可以鑒定的蛋白數(shù)量也更多。LC-MS/MS可以用于鑒定200個蛋白質(zhì)左右的蛋白混合物樣品，包括免疫沉淀樣品，Pull-down樣品等。