模式小鼠應(yīng)用：瑞金醫(yī)院團(tuán)隊(duì)首次發(fā)現(xiàn)人類RSPO1中突變會(huì)導(dǎo)致肥胖

肥胖是一個(gè)全球性的熱門話題，也推動(dòng)了對(duì)脂肪組織的深入研究。以往的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)多余的能量?jī)?chǔ)存在白色脂肪組織（WAT）時(shí)會(huì)發(fā)生肥胖，而棕色脂肪組織（BAT）則會(huì)促進(jìn)能量消耗以減少肥胖。在外界或生理刺激下，白色脂肪組織會(huì)發(fā)生“褐變”，形成米色脂肪細(xì)胞。這些含有豐富線粒體的米色脂肪細(xì)胞也能燃燒卡路里，被認(rèn)為是治療肥胖癥的一種潛在方法。

一些哺乳動(dòng)物遺傳模型已經(jīng)證明，基因突變可通過(guò)控制棕色/米色脂肪細(xì)胞產(chǎn)熱而導(dǎo)致肥胖。不過(guò)，目前還沒(méi)有足夠的證據(jù)，說(shuō)明控制產(chǎn)熱的人類基因中存在致病性突變。最近的遺傳學(xué)證據(jù)表明，Wnt通路的下游突變與脂肪分布有關(guān)，但無(wú)法證實(shí)Wnt相關(guān)突變與肥胖癥之間有因果關(guān)系。

近日，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院的王計(jì)秋/劉瑞欣/王衛(wèi)慶團(tuán)隊(duì)在《Advanced Science》雜志上發(fā)表論文，首次證實(shí)人類RSPO1基因中的一種突變會(huì)抑制米色脂肪細(xì)胞產(chǎn)熱并導(dǎo)致肥胖。這項(xiàng)成果也許對(duì)人類肥胖癥的治療具有重要意義。
 

圖片來(lái)源：Advanced Science

研究材料與方法
在這項(xiàng)研究中，研究人員在篩選出RSPO1突變后，委托賽業(yè)生物構(gòu)建了脂肪組織特異性的hRSPO1轉(zhuǎn)基因小鼠、Rspo1基因敲除小鼠和人源化的Rspo1 p.R219W小鼠，并在這些模型上分析RSPO1突變的影響。研究者采用EchoMRI體成分分析儀測(cè)定了活體小鼠的體脂成分，并通過(guò)RNA測(cè)序分析了各個(gè)小鼠模型上的基因表達(dá)變化。

技術(shù)路線
01 通過(guò)篩選肥胖病例和對(duì)照的測(cè)序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)多名患者攜帶相同的RSPO1突變
02 構(gòu)建hRSPO1轉(zhuǎn)基因小鼠和Rspo1基因敲除小鼠模型，發(fā)現(xiàn)RSPO1過(guò)表達(dá)導(dǎo)致肥胖，而Rspo1敲除促進(jìn)脂肪產(chǎn)熱
03 RSPO1通過(guò)LGR4-Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制米色脂肪細(xì)胞的線粒體呼吸和產(chǎn)熱作用
04 攜帶熱點(diǎn)突變的人源化小鼠模型再現(xiàn)了肥胖患者的特征
05 p.R219W突變破壞了RSPO1與細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)合，導(dǎo)致更多RSPO1釋放

研究結(jié)果
1.多個(gè)肥胖病例攜帶相同的RSPO1突變
為了研究Wnt相關(guān)因子的突變與人類肥胖的關(guān)系，研究人員利用全外顯子組測(cè)序?qū)?994個(gè)青少年肥胖病例和2161個(gè)健康對(duì)照的Wnt相關(guān)旁分泌因子進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)12例肥胖患者的RSPO1基因攜帶相同突變（p.R219W/Q）。RSPO1（R-spondin 1）是R-spondin分泌蛋白家族中的一員，可作為Wnt激活劑來(lái)增強(qiáng)Wnt信號(hào)通路。研究者發(fā)現(xiàn)，p.R219W/Q突變體對(duì)Wnt信號(hào)通路有相對(duì)更高的激活作用。

在分析各種器官和細(xì)胞系的基因表達(dá)譜后，研究者發(fā)現(xiàn)RSPO1在白色脂肪組織中特異性高表達(dá)。通過(guò)對(duì)兩種小鼠肥胖模型和肥胖受試者的分析，研究者發(fā)現(xiàn)RSPO1主要在內(nèi)臟白色脂肪組織中表達(dá)。在進(jìn)一步分析小鼠單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)后，研究者發(fā)現(xiàn)Rspo1主要在成纖維細(xì)胞中表達(dá)，而不是脂肪干細(xì)胞。這些結(jié)果表明，RSPO1在內(nèi)臟脂肪中高表達(dá)，主要由成纖維細(xì)胞產(chǎn)生，其局部水平與肥胖發(fā)展呈正相關(guān)。

2.RSPO1過(guò)表達(dá)促進(jìn)了HFD誘導(dǎo)的肥胖
為了研究脂肪組織中RSPO1增加是否會(huì)誘導(dǎo)肥胖，研究人員委托賽業(yè)生物構(gòu)建了一種hRSPO1轉(zhuǎn)基因小鼠模型（hRSPO1^Tg）。研究者發(fā)現(xiàn)，在以高脂飲食（HFD）喂養(yǎng)時(shí)，hRSPO1^Tg小鼠的體重增加比野生型小鼠更多，脂肪含量更高，而O₂消耗和CO₂產(chǎn)生更低（圖1），這表明人類RSPO1基因在脂肪組織中的過(guò)表達(dá)足以減少能量消耗，并促進(jìn)HFD誘導(dǎo)的肥胖。后續(xù)分析發(fā)現(xiàn)，脂肪組織中過(guò)量的RSPO1表達(dá)會(huì)抑制線粒體呼吸和棕色/米色脂肪細(xì)胞的產(chǎn)熱能力。
 

圖1 人源RSPO1過(guò)表達(dá)促進(jìn)飲食誘導(dǎo)的肥胖^[1]

為了進(jìn)一步分析Rspo1的作用，研究人員又構(gòu)建了Rspo1基因敲除（Rspo1^−/−）小鼠（由賽業(yè)生物提供）。以HFD喂養(yǎng)時(shí)，這些小鼠的體重比野生型小鼠更輕，全身脂肪量和白色脂肪組織重量也明顯減少，表明內(nèi)源性Rspo1的敲除增加了能量消耗并抵制了HFD誘導(dǎo)的肥胖。當(dāng)暴露于長(zhǎng)期寒冷時(shí)，Rspo1^−/−小鼠的白色脂肪組織表現(xiàn)出強(qiáng)烈的褐變程序，UCP1蛋白水平也顯著增加。由此可以看出，Rspo1的敲除促進(jìn)了白色脂肪向棕色脂肪的轉(zhuǎn)化。

在后續(xù)的機(jī)制分析中，研究者發(fā)現(xiàn)RSPO1對(duì)線粒體基因表達(dá)和米色脂肪細(xì)胞產(chǎn)熱的抑制作用主要依賴于Lgr4受體，而β-catenin也參與了RSPO1/LGR4對(duì)米色脂肪細(xì)胞的抑制作用（圖2）。Lgr4的敲除以及β-catenin的化學(xué)阻斷都減弱了RSPO1的抑制作用。這些數(shù)據(jù)顯示，RSPO1通過(guò)LGR4經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制了米色脂肪細(xì)胞的線粒體呼吸和產(chǎn)熱能力。
 

圖2 人源RSPO1蛋白以Lgr4/β-catenin依賴性的方式抑制米色脂肪細(xì)胞產(chǎn)熱^[1]

3.p.R219W/Q突變體破壞RSPO1與細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)合
為了進(jìn)一步明確RSPO1的p.R219W突變?cè)诜逝种械淖饔茫�研究人員利用CRISPR-Cas9方法構(gòu)建了p.R219W點(diǎn)突變基因敲入（Rspo1^R219W）小鼠模型（由賽業(yè)生物提供）。在HFD條件下，這種小鼠的體重增加比野生型小鼠更多，脂肪含量也更高。在急性寒冷刺激下，Rspo1^R219W小鼠的產(chǎn)熱能力下降，白色脂肪細(xì)胞的褐變程序也減弱。同時(shí)，在Rspo1^R219W小鼠的米色脂肪細(xì)胞中，產(chǎn)熱和線粒體呼吸相關(guān)基因的mRNA表達(dá)受到抑制，表明RSPO1 p.R219W突變可抑制產(chǎn)熱能力并導(dǎo)致肥胖。

那么，p.R219W/Q突變體是如何發(fā)揮病理作用的呢？研究者發(fā)現(xiàn)，R219殘基位于RSPO1的C端區(qū)域，而這個(gè)區(qū)域含有一些堿性氨基酸殘基，形成高密度的正電荷區(qū)域，有利于它們與細(xì)胞外基質(zhì)中的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG）結(jié)合，從而限制RSPO1在細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)的擴(kuò)散。色氨酸（W）和谷氨酰胺（Q）的替代影響了R219位點(diǎn)的正電荷特征，破壞了RSPO1與細(xì)胞外基質(zhì)的靜電相互作用，從而導(dǎo)致更多RSPO1蛋白釋放到細(xì)胞外空間，過(guò)度激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路（圖3）。
 

圖3 RSPO1 p.R219W/Q突變破壞了其與細(xì)胞外基質(zhì)的靜電相互作用并激活Wnt通路^[1]

研究結(jié)論
這項(xiàng)研究驗(yàn)證了人類RSPO1基因中的一個(gè)功能激活突變（p.R219W）可作為遺傳觸發(fā)器，驅(qū)動(dòng)高脂飲食喂養(yǎng)下的肥胖發(fā)生，它可能通過(guò)破壞RSPO1與細(xì)胞外基質(zhì)的靜電結(jié)合而抑制產(chǎn)熱能力。阻斷RSPO1信號(hào)可以促進(jìn)線粒體呼吸和產(chǎn)熱，減少脂肪堆積，這突出了其在治療人類肥胖癥中的意義。

原文檢索：
[1] Sun Y, Zhang J, Hong J, et al. Human RSPO1 Mutation Represses Beige Adipocyte Thermogenesis and Contributes to Diet-Induced Adiposity. Adv Sci (Weinh). 2023 Feb 8:e2207152. https://doi.org/10.1002/advs.202207152
 

Rspo1 Flox小鼠

品系名稱：
C57BL/6J-Rspo1^em1Cflox/Cya
品系編號(hào)：
CKOCMP-192199-Rspo1-B6J-VA
產(chǎn)品編號(hào)：
S-CKO-04549
應(yīng)用方向：
脂肪組織,生殖系統(tǒng),腎和泌尿系統(tǒng),內(nèi)/外分泌腺
打靶方案：