利用Octet解決AAV定量的痛點問題

上新了·Octet！解鎖新技能，輕松玩轉AAV定量
 
腺相關病毒 (Adeno-associated viruses, AAV) 作為一種基因遞送工具，具有安全性好、免疫原性低、能感染分裂細胞和非分裂細胞，能介導基因的長期穩(wěn)定表達等優(yōu)點，是目前基因治療中的首選載體，包括天然型（AAV）和重組型（rAAV）在內多種血清型。常用的AAV血清型有AAV1，2，5，6，7，8，9，rh10等，不同AAV血清型具有不同的衣殼蛋白空間結構，由于其組織特異性（或親嗜性）不同而被廣泛應用。



圖1. AAV載體療法占在研病毒載體基因療法的約80%



圖2. 不同血清型組織遞送特異性
 
 
AAV關鍵質量屬性評估
之病毒顆粒數

2022年5月，國家藥監(jiān)局藥審中心發(fā)布《體內基因治療產品藥學研究與評價技術指導原則（試行）》通告，病毒顆粒數是重要的質量分析指標之一。全新推出的Octet® AAVX腺相關病毒定量生物傳感器（貨號：18-5160），消除目前定量方法通量低、成本高、耗時長的技術瓶頸，一鍵解鎖各類血清學AAV病毒衣殼定量！

AAV定量痛點

• 為提高AAV病毒載體的質量和產品，需要在多個工藝步驟中快速定量AAV濃度，來高效地優(yōu)化生產工藝環(huán)節(jié)
• 目前的方法費時費力費錢，速度慢，難以優(yōu)化
• 時效性差，流程復雜。客戶需要將樣品送到分析部門或實驗室檢測，等待2~5天才會有結果。工藝流程需要等待結果進行下一步工作開展或優(yōu)化調整

Octet® AAVX定量解決方案

• 基于藥典認可的生物層干涉（BLI）技術
• Octet® R8/RH16/RH96高通量分子互作平臺
• 5分鐘即可一次性檢測8/16/96個樣品
• AAVX生物傳感器，一步法直接定量純化或粗樣品
• 可結合各種血清型：AAV1 ~ AAV9及AAVrh10
• 線性范圍寬廣：8.5×108 ~ 1×1013 vp/mL
• 可再生重復使用~20次，單個樣品檢測成本更低
• Octet® BLI Discovery v.13.0.1 軟件預設AAV定量模板

特異性高，動態(tài)范圍廣

Octet® AAVX傳感器對AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9和AAVrh10等10種不同的AAV血清型具有良好特異性。



圖3. Octet® AAVX對10種AAV血清型的特異性結合

大多數血清型的動態(tài)范圍在8.5x108至1.0x1013 vp/mL之間，線性范圍跨越5個數量級，無論高滴度和低滴度樣品都能得到準確測量。且動態(tài)范圍內測試的所有濃度均觀察到良好的回收率 (80–120%) 和精密度 (CV<10%)。



圖4. 使用Octet® AAVX生物傳感器對純化的AAV9衣殼定量



輕松消除基質干擾，粗樣品表現(xiàn)優(yōu)異

AAV的整個生產流程會用到不同的緩沖液和培養(yǎng)基基質，Octet® 對純化樣品和粗制樣品均表現(xiàn)出優(yōu)異的處理能力。使用樣品稀釋劑緩沖液對粗樣品進行4倍至10倍稀釋，即可顯著減輕樣品中基質效應。

點擊了解不同血清型和
基質類型最小稀釋系數


圖6. 使用Octet® AAVX生物傳感器對AAV9粗樣品衣殼定量（含 1% Pluronic F-68的裂解緩沖液，稀釋比例3:1；n=3）。結果顯示濃度為3.05x109–2.22x1012 vp/mL。樣品回收率在95–105%之間，并且受測濃度具有良好的精密度（CV<10%）。
 
 
與ELISA相關性

Octet® BLI搭配AAVX傳感器可以實現(xiàn)快速的檢測設置、分析和實時數據顯示，從而能夠監(jiān)控和優(yōu)化每個檢測步驟。為了證實Octet® AAVX檢測法和ELISA之間的相關性，來自BridgeBio Pharma和REGENXBIO公司的研究人員在AAV生物工藝流程的不同步驟測試了樣品中的不同AAV血清型。



圖7. 使用Octet® AAVX生物傳感器和ELISA定量檢測純化樣品及粗制樣品（生物工藝中間體）中的AAV8和AAV9，數據顯示兩種方法具有良好的相關性。數據由REGENXBIO Inc.提供。



圖8. 使用Octet® AAVX生物傳感器和ELISA定量檢測AAV生產上游和下游不同步驟中的AAV5（包括純化樣品及粗制樣品）滴度。滴度范圍為6.73x109至9.59x1013 vp/mL，證明Octet® AAVX檢測法與ELISA之間具有良好的相關性。數據由BridgeBio Pharma, Inc.提供。


簡單便捷，全面優(yōu)化
 

方法	實驗成本	樣品制備	CV%	檢測時間
Octet® AAVX	可以再生并重復使用多達20次, <5元/樣品	無需或少量稀釋，即可直接檢測，不受基質影響	< 10%	R8：90min/96孔板 RH16：45min/96孔板 RH96：5min/96孔板
ELISA Kit	10-20倍*	需稀釋上千倍，需要復孔，制備復雜，含包被、洗滌、孵育、二抗、終止等步驟	0-Jan-00	200~240min/96孔板
ddPCR	10-20倍*	需要樣品100倍倍比稀釋，裂解、液滴制備等步驟	< 10%	360~480min/96孔板

*與Octet® AAVX對比

總結

基于Octet® BLI 和Octet® AAVX 生物傳感器的AAV定量檢測策略可廣泛應用于AAV 上游和下游工藝各階段，優(yōu)化傳統(tǒng)終點法耗時費力的確定，提供可靠、準確且便捷的AAV定量新思路。

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