LncRNA FER1L4介導(dǎo)正畸壓力作用下牙周膜干細(xì)胞的自噬
正畸牙齒移動是通過施加機(jī)械力來實現(xiàn)的，然后是牙周組織重塑和再生。牙齒將力傳遞到牙周膜，牙周膜將力分布與牙槽骨，牙槽骨發(fā)生組織改建產(chǎn)生牙移動。牙周膜干細(xì)胞（PDLSCs）是介導(dǎo)正畸力轉(zhuǎn)導(dǎo)和牙周組織重塑的機(jī)械敏感細(xì)胞。進(jìn)一步研究PDLSCs對正畸力的反應(yīng)并更好地了解這種機(jī)制對于改善正畸治療方法至關(guān)重要。
自噬是一種基本的細(xì)胞內(nèi)過程，介導(dǎo)細(xì)胞器降解和再循環(huán)以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。先前的研究表明，自噬在專門的機(jī)械敏感細(xì)胞中起到機(jī)械適應(yīng)作用。它在髓核細(xì)胞中增加以響應(yīng)壓縮力刺激，但在足細(xì)胞中減少。然而，在正畸壓縮力的作用下，自噬在牙周膜中的作用仍然在很大程度上是未知的。研究初步發(fā)現(xiàn)，在生物力學(xué)負(fù)荷下，牙周膜成纖維細(xì)胞的自噬增加。然而，在牙齒移動過程中，自噬在壓縮區(qū)域受到調(diào)節(jié)的確切機(jī)制尚不清楚。
長鏈非編碼RNAs（lncRNAs）是長度大于200個核苷酸的轉(zhuǎn)錄本，成為自噬領(lǐng)域的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。研究表明，lncRNAs通過調(diào)節(jié)自噬參與各種細(xì)胞途徑，包括缺血和再灌注損傷，腫瘤發(fā)生，心血管疾病和糖尿病等。Fer-1樣家族成員4（FER1L4）是一種新發(fā)現(xiàn)的 lncRNA，已被證明與某些類型的癌癥有關(guān)，包括肺癌、肝細(xì)胞癌、骨肉瘤和子宮內(nèi)膜癌。然而，還沒有研究調(diào)查FER1L4在自噬中的功能和機(jī)制。
因此，北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院正畸科、口腔數(shù)字化醫(yī)療技術(shù)和材料國家工程實驗室研究團(tuán)隊曾探討了PDLSCs在壓縮力下的自噬活性，并進(jìn)一步確定lncRNA FER1L4對PDLSCs在機(jī)械應(yīng)力下的自噬是否重要，如果重要，潛在的機(jī)制是什么。
壓縮力作用下PDLSCs中自噬被誘導(dǎo)
將牙周膜干細(xì)胞暴露于靜態(tài)壓縮力下（2 g/cm2）12小時（圖1 A）。CCK-8測定顯示，有或沒有壓縮力組細(xì)胞增殖相似（圖1 B）。流式細(xì)胞術(shù)分析也證實，與對照組相比，壓縮力組的細(xì)胞凋亡和壞死無顯著差異（圖1 C）。進(jìn)一步測定自噬活性。自噬的兩種生物標(biāo)志物L(fēng)C3 II/I和Beclin1的表達(dá)水平在壓縮力組中較高（圖1 D）。在熒光顯微鏡下自噬體以多個明亮的綠色熒光斑點存在。壓縮力組LC3呈點狀分布，在核周和細(xì)胞質(zhì)區(qū)域周圍始終顯著（圖1 E）。TEM也用于檢測自噬流。自噬體定義為PDLSCs細(xì)胞質(zhì)中含有細(xì)胞碎片或降解細(xì)胞器的雙膜囊泡，在壓縮力組中增加（圖1 F）。為了確定自噬的作用，用自噬抑制劑氯喹（10 μM）處理PDLSCs。結(jié)果表明，抑制自噬流后凋亡細(xì)胞顯著增加（圖1 G）。當(dāng)用自噬抑制劑預(yù)處理細(xì)胞時，輕度壓縮力（2 g/cm2）誘導(dǎo)顯著的細(xì)胞凋亡（圖1 H）。
圖1 PDLSCs在壓縮作用下的自噬增加。將細(xì)胞施加靜態(tài)壓縮力12小時。
LncRNA FER1L4在受壓縮力作用的PDLSCs中顯著上調(diào)
先前的RNA測序原始數(shù)據(jù)顯示，在壓縮力作用下，PDLSCs中的FER1L4顯著增加（約7倍）。為了進(jìn)一步研究FER1L4的作用，使用FISH技術(shù)在熒光顯微鏡下觀察FER1L4的分布。結(jié)果表明，F(xiàn)ER1L4位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。靜態(tài)壓縮力刺激后，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中FER1L4的強度均增加。
FER1L4介導(dǎo)由壓縮力誘導(dǎo)的PDLSCs的自噬
為了研究FER1L4在PDLSCs自噬調(diào)節(jié)中的作用，實驗進(jìn)行了功能獲得和功能喪失測定。pQLL-FER1L4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組FER1L4表達(dá)顯著升高，siFER1L4轉(zhuǎn)染組FER1L4表達(dá)顯著降低（圖2 A）。
用pQLL-FER1L4載體轉(zhuǎn)染后，蛋白質(zhì)印跡分析顯示，自噬標(biāo)志物L(fēng)C3 II/I和Beclin1的蛋白表達(dá)上調(diào)（圖2 B）。共聚焦顯微鏡下FER1L4過表達(dá)組LC3點狀的細(xì)胞質(zhì)形成顯著增加，表明自噬體形成顯著增加（圖2 C）。TEM進(jìn)一步證實了自噬體和自噬溶酶體的形成。轉(zhuǎn)染FER1L4載體后，PDLSCs細(xì)胞質(zhì)中的自噬體和自噬溶酶體數(shù)量增加（圖2 D）。
為了確定FER1L4是否介導(dǎo)PDLSCs在壓縮力下的自噬，用siFER1L4預(yù)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，然后暴露于機(jī)械應(yīng)力12小時，結(jié)果表明，通過敲低FER1L4，機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)的LC3 II/I和Beclin1表達(dá)均被消除（圖2 E）。
FER1L4在施加外部壓縮力期間通過AKT/FOXO3信號通路調(diào)節(jié)自噬
AKT信號通路在自噬的負(fù)調(diào)控中很重要。為了研究FER1L4是否調(diào)節(jié)PDLSCs中的AKT信號通路，實驗進(jìn)行了蛋白質(zhì)印跡分析，結(jié)果表明，F(xiàn)ER1L4過表達(dá)抑制了AKT（p-AKT）的磷酸化，而AKT總量幾乎保持不變（圖3 A）。伴隨p-AKT的降低，觀察到p-FOXO3的顯著降低和FOXO3表達(dá)的增加（圖3 A）。免疫熒光測定也檢測了FOXO3蛋白的定位。FER1L4過表達(dá)組FOXO3免疫染色較強（圖3 B）。而在FER1L4敲低細(xì)胞中，AKT的磷酸化和FOXO3的磷酸化上調(diào)，F(xiàn)OXO3的表達(dá)下調(diào)（圖3 C）。免疫染色也顯示 FER1L4 敲低組 FOXO3 的熒光染色相對較弱（圖3 D）。
為了進(jìn)一步確定FER1L4是否通過AKT/FOXO3信號通路介導(dǎo)壓縮力下PDLSCs的自噬，實驗隨后研究了在施加壓縮力期間該通路的激活情況�；� KEGG 數(shù)據(jù)庫對先前RNA測序數(shù)據(jù)的通路分析表明，機(jī)械應(yīng)力顯著影響PI3K/AKT信號通路。一致地，暴露于壓縮力的PDLSCs中p-AKT和p-FOXO3顯著降低，而FOXO3的核易位增加。然而，當(dāng)細(xì)胞用siFER1L4預(yù)轉(zhuǎn)染時，敲低FER1L4后，壓縮力引起的p-AKT和p-FOXO3的抑制作用和FOXO3的激活作用均消失。
Fer1l4和自噬標(biāo)志物在正畸牙壓縮牙周膜中的表達(dá)上調(diào)
為了確定FER1L4和自噬在牙周膜對正畸力的反應(yīng)中的功能，實驗使用了小鼠正畸牙齒移動模型。FISH檢測顯示，F(xiàn)er1l4 RNA的熒光染色強度在牙周膜的壓縮區(qū)顯著誘導(dǎo)，而對照組牙周膜的熒光強度較低。此外，還確定了正畸牙齒受壓力下牙周膜中的自噬。免疫組織化學(xué)染色顯示，在應(yīng)用正畸加壓的區(qū)域，自噬標(biāo)志物L(fēng)c3的活性增加。
綜上所述，該研究表明，正畸壓縮力誘導(dǎo)牙周膜干細(xì)胞自噬，lncRNA FER1L4通過AKT/FOXO3通路介導(dǎo)壓縮力作用下自噬的激活（圖4）。這些發(fā)現(xiàn)表明了lncRNA在正畸牙齒移動的牙周組織重塑過程中自噬調(diào)控的機(jī)制。
參考文獻(xiàn)：Huang Y, Liu H, Guo R, Han Y, Yang Y, Zhao Y, Zheng Y, Jia L, Li W. Long Non-coding RNA FER1L4 Mediates the Autophagy of Periodontal Ligament Stem Cells Under Orthodontic Compressive Force via AKT/FOXO3 Pathway. Front Cell Dev Biol. 2021 Feb 2;9:631181. doi: 10.3389/fcell.2021.631181. PMID: 33604341; PMCID: PMC7884613.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33604341/
小編旨在分享、學(xué)習(xí)、交流生物科學(xué)等領(lǐng)域的研究進(jìn)展。如有侵權(quán)或引文不當(dāng)請聯(lián)系小編修正。
微信搜索公眾號“Naturethink”，了解更多細(xì)胞體外仿生培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用。
自噬是一種基本的細(xì)胞內(nèi)過程，介導(dǎo)細(xì)胞器降解和再循環(huán)以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。先前的研究表明，自噬在專門的機(jī)械敏感細(xì)胞中起到機(jī)械適應(yīng)作用。它在髓核細(xì)胞中增加以響應(yīng)壓縮力刺激，但在足細(xì)胞中減少。然而，在正畸壓縮力的作用下，自噬在牙周膜中的作用仍然在很大程度上是未知的。研究初步發(fā)現(xiàn)，在生物力學(xué)負(fù)荷下，牙周膜成纖維細(xì)胞的自噬增加。然而，在牙齒移動過程中，自噬在壓縮區(qū)域受到調(diào)節(jié)的確切機(jī)制尚不清楚。
長鏈非編碼RNAs（lncRNAs）是長度大于200個核苷酸的轉(zhuǎn)錄本，成為自噬領(lǐng)域的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。研究表明，lncRNAs通過調(diào)節(jié)自噬參與各種細(xì)胞途徑，包括缺血和再灌注損傷，腫瘤發(fā)生，心血管疾病和糖尿病等。Fer-1樣家族成員4（FER1L4）是一種新發(fā)現(xiàn)的 lncRNA，已被證明與某些類型的癌癥有關(guān)，包括肺癌、肝細(xì)胞癌、骨肉瘤和子宮內(nèi)膜癌。然而，還沒有研究調(diào)查FER1L4在自噬中的功能和機(jī)制。
因此，北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院正畸科、口腔數(shù)字化醫(yī)療技術(shù)和材料國家工程實驗室研究團(tuán)隊曾探討了PDLSCs在壓縮力下的自噬活性，并進(jìn)一步確定lncRNA FER1L4對PDLSCs在機(jī)械應(yīng)力下的自噬是否重要，如果重要，潛在的機(jī)制是什么。
壓縮力作用下PDLSCs中自噬被誘導(dǎo)
將牙周膜干細(xì)胞暴露于靜態(tài)壓縮力下（2 g/cm2）12小時（圖1 A）。CCK-8測定顯示，有或沒有壓縮力組細(xì)胞增殖相似（圖1 B）。流式細(xì)胞術(shù)分析也證實，與對照組相比，壓縮力組的細(xì)胞凋亡和壞死無顯著差異（圖1 C）。進(jìn)一步測定自噬活性。自噬的兩種生物標(biāo)志物L(fēng)C3 II/I和Beclin1的表達(dá)水平在壓縮力組中較高（圖1 D）。在熒光顯微鏡下自噬體以多個明亮的綠色熒光斑點存在。壓縮力組LC3呈點狀分布，在核周和細(xì)胞質(zhì)區(qū)域周圍始終顯著（圖1 E）。TEM也用于檢測自噬流。自噬體定義為PDLSCs細(xì)胞質(zhì)中含有細(xì)胞碎片或降解細(xì)胞器的雙膜囊泡，在壓縮力組中增加（圖1 F）。為了確定自噬的作用，用自噬抑制劑氯喹（10 μM）處理PDLSCs。結(jié)果表明，抑制自噬流后凋亡細(xì)胞顯著增加（圖1 G）。當(dāng)用自噬抑制劑預(yù)處理細(xì)胞時，輕度壓縮力（2 g/cm2）誘導(dǎo)顯著的細(xì)胞凋亡（圖1 H）。
圖1 PDLSCs在壓縮作用下的自噬增加。將細(xì)胞施加靜態(tài)壓縮力12小時。
LncRNA FER1L4在受壓縮力作用的PDLSCs中顯著上調(diào)
先前的RNA測序原始數(shù)據(jù)顯示，在壓縮力作用下，PDLSCs中的FER1L4顯著增加（約7倍）。為了進(jìn)一步研究FER1L4的作用，使用FISH技術(shù)在熒光顯微鏡下觀察FER1L4的分布。結(jié)果表明，F(xiàn)ER1L4位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。靜態(tài)壓縮力刺激后，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中FER1L4的強度均增加。
FER1L4介導(dǎo)由壓縮力誘導(dǎo)的PDLSCs的自噬
為了研究FER1L4在PDLSCs自噬調(diào)節(jié)中的作用，實驗進(jìn)行了功能獲得和功能喪失測定。pQLL-FER1L4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組FER1L4表達(dá)顯著升高，siFER1L4轉(zhuǎn)染組FER1L4表達(dá)顯著降低（圖2 A）。
用pQLL-FER1L4載體轉(zhuǎn)染后，蛋白質(zhì)印跡分析顯示，自噬標(biāo)志物L(fēng)C3 II/I和Beclin1的蛋白表達(dá)上調(diào)（圖2 B）。共聚焦顯微鏡下FER1L4過表達(dá)組LC3點狀的細(xì)胞質(zhì)形成顯著增加，表明自噬體形成顯著增加（圖2 C）。TEM進(jìn)一步證實了自噬體和自噬溶酶體的形成。轉(zhuǎn)染FER1L4載體后，PDLSCs細(xì)胞質(zhì)中的自噬體和自噬溶酶體數(shù)量增加（圖2 D）。
為了確定FER1L4是否介導(dǎo)PDLSCs在壓縮力下的自噬，用siFER1L4預(yù)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，然后暴露于機(jī)械應(yīng)力12小時，結(jié)果表明，通過敲低FER1L4，機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)的LC3 II/I和Beclin1表達(dá)均被消除（圖2 E）。
圖2 FER1L4促進(jìn)PDLSCs的自噬水平。
FER1L4在施加外部壓縮力期間通過AKT/FOXO3信號通路調(diào)節(jié)自噬
AKT信號通路在自噬的負(fù)調(diào)控中很重要。為了研究FER1L4是否調(diào)節(jié)PDLSCs中的AKT信號通路，實驗進(jìn)行了蛋白質(zhì)印跡分析，結(jié)果表明，F(xiàn)ER1L4過表達(dá)抑制了AKT（p-AKT）的磷酸化，而AKT總量幾乎保持不變（圖3 A）。伴隨p-AKT的降低，觀察到p-FOXO3的顯著降低和FOXO3表達(dá)的增加（圖3 A）。免疫熒光測定也檢測了FOXO3蛋白的定位。FER1L4過表達(dá)組FOXO3免疫染色較強（圖3 B）。而在FER1L4敲低細(xì)胞中，AKT的磷酸化和FOXO3的磷酸化上調(diào)，F(xiàn)OXO3的表達(dá)下調(diào)（圖3 C）。免疫染色也顯示 FER1L4 敲低組 FOXO3 的熒光染色相對較弱（圖3 D）。
為了進(jìn)一步確定FER1L4是否通過AKT/FOXO3信號通路介導(dǎo)壓縮力下PDLSCs的自噬，實驗隨后研究了在施加壓縮力期間該通路的激活情況�；� KEGG 數(shù)據(jù)庫對先前RNA測序數(shù)據(jù)的通路分析表明，機(jī)械應(yīng)力顯著影響PI3K/AKT信號通路。一致地，暴露于壓縮力的PDLSCs中p-AKT和p-FOXO3顯著降低，而FOXO3的核易位增加。然而，當(dāng)細(xì)胞用siFER1L4預(yù)轉(zhuǎn)染時，敲低FER1L4后，壓縮力引起的p-AKT和p-FOXO3的抑制作用和FOXO3的激活作用均消失。
圖3 FER1L4抑制AKT的磷酸化，增加FOXO3的核易位。
Fer1l4和自噬標(biāo)志物在正畸牙壓縮牙周膜中的表達(dá)上調(diào)
為了確定FER1L4和自噬在牙周膜對正畸力的反應(yīng)中的功能，實驗使用了小鼠正畸牙齒移動模型。FISH檢測顯示，F(xiàn)er1l4 RNA的熒光染色強度在牙周膜的壓縮區(qū)顯著誘導(dǎo)，而對照組牙周膜的熒光強度較低。此外，還確定了正畸牙齒受壓力下牙周膜中的自噬。免疫組織化學(xué)染色顯示，在應(yīng)用正畸加壓的區(qū)域，自噬標(biāo)志物L(fēng)c3的活性增加。
圖4 FER1L4通過AKT/FOXO3通路介導(dǎo)正畸壓縮力作用下牙周膜干細(xì)胞自噬的示意圖。
綜上所述，該研究表明，正畸壓縮力誘導(dǎo)牙周膜干細(xì)胞自噬，lncRNA FER1L4通過AKT/FOXO3通路介導(dǎo)壓縮力作用下自噬的激活（圖4）。這些發(fā)現(xiàn)表明了lncRNA在正畸牙齒移動的牙周組織重塑過程中自噬調(diào)控的機(jī)制。
參考文獻(xiàn)：Huang Y, Liu H, Guo R, Han Y, Yang Y, Zhao Y, Zheng Y, Jia L, Li W. Long Non-coding RNA FER1L4 Mediates the Autophagy of Periodontal Ligament Stem Cells Under Orthodontic Compressive Force via AKT/FOXO3 Pathway. Front Cell Dev Biol. 2021 Feb 2;9:631181. doi: 10.3389/fcell.2021.631181. PMID: 33604341; PMCID: PMC7884613.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33604341/
小編旨在分享、學(xué)習(xí)、交流生物科學(xué)等領(lǐng)域的研究進(jìn)展。如有侵權(quán)或引文不當(dāng)請聯(lián)系小編修正。
微信搜索公眾號“Naturethink”，了解更多細(xì)胞體外仿生培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用。
Copyright(C) 1998-2024 生物器材網(wǎng) 電話：021-64166852;13621656896 E-mail：info@bio-equip.com