心肌細(xì)胞特異性circHIPK3敲除小鼠助力揭示心肌再生修復(fù)新機(jī)制

心肌梗死和心力衰竭等心血管疾病的發(fā)病率隨著年齡的增長而增加。衰老是導(dǎo)致心血管疾病發(fā)展的一個主要因素，但其潛在的分子機(jī)制在很大程度上仍然未知，原因之一是缺乏合適的動物模型。

2022年10月31日，蘇州大學(xué)心血管病研究所李楊欣教授團(tuán)隊在生物醫(yī)學(xué)1區(qū)雜志《Theranostics》（IF=11.6）期刊上發(fā)表了一篇題為“circHIPK3 prevents cardiac senescence by acting as a scaffold to recruit ubiquitin ligase to degrade HuR”的研究論文，揭示了心肌修復(fù)再生的新機(jī)制。研究生丁鳳枝、陸琳和吳誠潔是論文的共同第一作者，李楊欣教授是通訊作者。
 

來源：Theranostics

研究材料與方法
在這項(xiàng)研究中，研究人員使用了由賽業(yè)生物提供的他莫昔芬誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞特異性circHIPK3敲除小鼠。在整個實(shí)驗(yàn)過程中，他們使用了RNA測序、蛋白測序、流式細(xì)胞術(shù)、心功能檢測、蛋白印跡、RNA和蛋白共沉淀、circHIPK3慢病毒表達(dá)等技術(shù)方法。

研究結(jié)果
1.circHIPK3在年輕和中年小鼠心臟中的表達(dá)及影響
研究者對不同年齡的小鼠心臟進(jìn)行RNA-seq，分析得到circHIPK3來源于HIPK3基因外顯子2，是一種高表達(dá)且高度保守的circRNA。同時檢測到circHIPK3在小鼠心、肝、脾、肺和腎臟等組織中均有表達(dá)，在心臟中表達(dá)最多。隨后研究者發(fā)現(xiàn)circHIPK3在心臟中的表達(dá)水平隨著年齡的增長而降低，這提示了circHIPK3可能在心臟衰老的發(fā)展中發(fā)揮著重要作用（圖1）。
 

circHIPK3在年輕和中年小鼠心臟中的表達(dá)及影響^[4]

2.circHIPK3敲除誘導(dǎo)小鼠心臟衰老
為了證實(shí)circHIPK3在心臟衰老中的作用^[1]，研究者用賽業(yè)構(gòu)建的他莫昔芬誘導(dǎo)心肌細(xì)胞特異性circHIPK3敲除小鼠，發(fā)現(xiàn)與同窩的circHIPK3^Flox/Flox小鼠相比，KO小鼠的心功能下降，小鼠端粒長度縮短，p16和p21表達(dá)增加，小鼠的繁殖速度非常慢，這表明circHIPK3的缺失損害了發(fā)育。這些數(shù)據(jù)表明，circHIPK3缺失導(dǎo)致心臟早期衰老和心功能障礙（圖2）。
 

circHIPK3的敲除誘導(dǎo)小鼠心臟衰老^[4]

3.circHIPK3調(diào)控HuR蛋白表達(dá)
為了了解為什么circHIPK3缺失會導(dǎo)致p21上調(diào)，研究者通過circRNA相互作用網(wǎng)站（https://circinteractome.nia.nih.gov/）分析了circHIPK3可能的靶蛋白。分析沒有發(fā)現(xiàn)p21或p16是circHIPK3的靶點(diǎn)，但是在人源中發(fā)現(xiàn)HuR和circHIPK3之間有三個結(jié)合位點(diǎn)。隨后RPISeq分析（http://pridb.gdcb.iastate.edu/RPISeq）證實(shí)circHIPK3在小鼠中與HuR結(jié)合，且HuR蛋白在人和小鼠之間高度保守^[2]。通過PPI數(shù)據(jù)庫（https://www.string-db.org/）分析發(fā)現(xiàn)，HuR通過調(diào)節(jié)SIRT1、細(xì)胞周期相關(guān)蛋白和端粒長度參與衰老的發(fā)展，這表明HuR蛋白可能直接參與衰老過程。重要的是，HuR與p21 mRNA 3'-UTR區(qū)域的ARE結(jié)合，增加其穩(wěn)定性，最終導(dǎo)致p21蛋白在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)增強(qiáng)（圖3）。
 

circHIPK3調(diào)控HuR蛋白表達(dá)^[4]

4.circHIPK3作為HuR和E3泛素連接酶的支架，促進(jìn)HuR降解
前期研究表明，HuR可通過泛素-蛋白酶體途徑與E3泛素連接酶β-TrCP相互作用降解^[3]。事實(shí)上，在PPI數(shù)據(jù)庫中可以找到HuR與E3泛素連接酶β-TrCP之間的相互作用。研究者試圖用特定的蛋白酶體抑制劑MG132處理H9C2細(xì)胞，以阻止蛋白質(zhì)通過蛋白酶體降解，以確定circHIPK3誘導(dǎo)的HuR蛋白下調(diào)是否由泛素-蛋白酶體系統(tǒng)介導(dǎo)。MG132處理增強(qiáng)了敲低circHIPK3誘導(dǎo)的HuR在細(xì)胞質(zhì)中的積累，說明HuR被蛋白酶體降解，而敲低circHIPK3細(xì)胞中相對較高的HuR水平是由于抑制了HuR的降解。

RNA-pulldown同WB判定了circHIPK3和HuR之間的結(jié)合，RIP實(shí)驗(yàn)和qRT-PCR再次驗(yàn)證二者結(jié)合。這表明circHIPK3可能通過直接相互作用調(diào)節(jié)HuR的穩(wěn)定性（圖4）。
 

circHIPK3作為HuR和E3泛素連接酶的支架，促進(jìn)HuR降解^[4]

5.外泌體通過釋放circHIPK3來防止心肌細(xì)胞衰老
外泌體含有非編碼RNA，包括microRNA、lncRNA和circRNA。有研究表明，間充質(zhì)來源的外泌體（UMSC-Exos）可抑制衰老引起的血管功能障礙和心功能障礙。研究者發(fā)現(xiàn)circHIPK3在外泌體中富集。外泌體circHIPK3處理可導(dǎo)致H9C2細(xì)胞中circHIPK3表達(dá)上調(diào)，并促進(jìn)H9C2細(xì)胞增殖，抑制衰老，降低p16和p21的表達(dá)。不過，敲低circHIPK3可抑制外泌體對衰老的保護(hù)作用。這些結(jié)果表明了外泌體通過傳遞circHIPK3促進(jìn)H9C2細(xì)胞增殖并抑制其衰老（圖5）。
 

外泌體通過釋放circHIPK3來防止CM衰老^[4]

研究結(jié)論
研究者發(fā)現(xiàn)了circHIPK3的缺失導(dǎo)致心肌細(xì)胞衰老加劇和心臟功能下降，circHIPK3作為支架增強(qiáng)了細(xì)胞質(zhì)中E3泛素連接酶β-TrCP和HuR的結(jié)合，導(dǎo)致HuR的泛素化和降解，從而降低了衰老誘導(dǎo)因子p21活性。此外，間充質(zhì)來源的外泌體通過遞送circHIPK3發(fā)揮了抗衰老和心臟保護(hù)作用。該研究提出了可用于研究心肌衰老的新動物模型，并在體內(nèi)外進(jìn)一步發(fā)掘了間充質(zhì)來源的外泌體中環(huán)狀非編碼RNA在組織修復(fù)再生中的新機(jī)制，這些發(fā)現(xiàn)為心肌修復(fù)再生提供了新思路。
 

circHIPK3/HuR/p21在心臟早衰中的調(diào)控機(jī)制^[4]

參考文獻(xiàn)：
[1] Zheng Q, Bao C, Guo W, Li S, Chen J, Chen B, et al. Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs. Nat Commun. 2016; 7: 11215.

[2] Sun Q, Tripathi V, Yoon JH, Singh DK, Hao Q, Min KW, et al. MIR100 host gene-encoded lncRNAs regulate cell cycle by modulating the interaction between HuR and its target mRNAs. Nucleic Acids Res. 2018; 46: 10405-16.

[3] Lan Y, Xiao X, He Z, Luo Y, Wu C, Li L, et al. Long noncoding RNA OCC-1 suppresses cell growth through destabilizing HuR protein in colorectal cancer. Nucleic Acids Res. 2018; 46: 5809-21.

[4] Fengzhi Ding, Lin Lu, Chengjie Wu, Xiangbin Pan, Bin Liu, Yu Zhang, Yanli Wang, Weiliang Wu, Bing Yan, Yuqing Zhang, Xi-Yong Yu, Yangxin Li, et al.Theranostics 2022; 12(17):7550-7566. doi:10.7150/thno.77630
 

Hipk3 KO小鼠

品系名稱：
C57BL/6J-Hipk3^em1C/Cya
品系編號：
KOCMP-15259-Hipk3-B6J-VA
產(chǎn)品編號：
S-KO-02454
應(yīng)用方向：
心血管系統(tǒng),神經(jīng)系統(tǒng),細(xì)胞生物學(xué),代謝研究,生理系統(tǒng)

打靶方案：

Hipk3 flox小 鼠

品系名稱：
C57BL/6J-Hipk3^em1Cflox/Cya
品系編號：
CKOCMP-15259-Hipk3-B6J-VA
產(chǎn)品編號：
S-CKO-02894
應(yīng)用方向：
心血管系統(tǒng),神經(jīng)系統(tǒng),細(xì)胞生物學(xué),代謝研究,生理系統(tǒng)

打靶方案：