體外血管生成三維培養(yǎng)模型構(gòu)建應(yīng)用指南

血管生成介紹

血管生成（Angiogenesis）是從原有的血管出芽形成新生血管的過(guò)程，在許多生理和病理過(guò)程中起重要作用，例如腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移、炎癥等。血管生成微環(huán)境對(duì)于開發(fā)針對(duì)這些病理的療法至關(guān)重要，內(nèi)皮細(xì)胞可以從靜止?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)檠�管生成狀態(tài)，導(dǎo)致遷移，這在常規(guī) 2D 培養(yǎng)方法中難以檢測(cè)到。重要的是，缺乏精確模擬這種具有可調(diào)性質(zhì)的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的體外模型，以深入了解這種微環(huán)境條件。
目前血管生成的研究高度依賴于天然ECM（如Matrigel），其具有不可調(diào)的水凝膠組成成分和性質(zhì)。這種傳統(tǒng)方法只允許對(duì)培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)因子或抑制劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，不支持關(guān)于ECM的某些特性如何影響血管生成的研究。因此，非常需要具有可調(diào)血管生成微環(huán)境的可靠人類血管生成模型，以增加我們對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)的病理學(xué)的理解。這種先進(jìn)的模型可以提供關(guān)于內(nèi)皮細(xì)胞如何經(jīng)歷形態(tài)變化或與鄰近細(xì)胞相互作用以響應(yīng)某些刺激影響血管生成的新信息，并增加我們對(duì)血管疾病、中風(fēng)、高血壓等病理生理學(xué)的理解。
 
VitroGel血管生成試劑盒是研究水凝膠特性和培養(yǎng)基對(duì)血管生成過(guò)程影響的革命性工具。無(wú)異源功能性水凝膠系統(tǒng)的可調(diào)節(jié)特性，使研究人員能夠輕松、高效地研究此類過(guò)程，并具有建立體外血管生成模型的良好控制。該系統(tǒng)可輕松允許內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)2D水凝膠包被或3D培養(yǎng)促進(jìn)血管形成、侵襲以及動(dòng)物注射。


TheWell提供兩款VitroGel血管生成試劑盒：

✦ VitroGel Angiogenesis Assay Kit（即用型體外血管生成試劑盒）：VitoGel AAK（貨號(hào)：VHM06-K），具有固定的水凝膠機(jī)械強(qiáng)度，含有不同的生長(zhǎng)因子添加物來(lái)調(diào)節(jié)水凝膠內(nèi)的生長(zhǎng)因子;

✦ VitroGel Angiogenesis Assay HC Kit（高濃度體外血管生成試劑盒）：AAK-HC（貨號(hào)：TWG011-K），具有可調(diào)的高濃度水凝膠，可以完全控制水凝膠的機(jī)械強(qiáng)度和生長(zhǎng)因子添加物來(lái)調(diào)節(jié)水凝膠內(nèi)的生長(zhǎng)因子。

- 以下實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與結(jié)果皆來(lái)源于TheWell實(shí)驗(yàn)室。

我們使用即用型VitroGel Angiogenesis Assay Kit和高濃度VitroGel Angiogenesis Assay HC Kit來(lái)證明水凝膠特性修飾對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）血管生成檢測(cè)的影響。

實(shí)驗(yàn)從2D水凝膠包被培養(yǎng)方法開始，其中我們?cè)诩?xì)胞培養(yǎng)板底部從VitroGel AAK制備了一層厚厚的水凝膠，并將HUVEC細(xì)胞接種在水凝膠層的頂部。HUVEC血管生成對(duì)不同的水凝膠組成（血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）陽(yáng)性，VEGF陰性或無(wú)生長(zhǎng)因子）表現(xiàn)出顯著差異，即使使用相同的內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基，也顯示不同的管腔結(jié)構(gòu)和血管形成。另一方面，我們能夠通過(guò)使用VitroGel AAK-HC來(lái)調(diào)節(jié)水凝膠濃度。數(shù)據(jù)表明，除了基質(zhì)內(nèi)的生長(zhǎng)因子外，機(jī)械性能還會(huì)嚴(yán)重影響細(xì)胞活力和管形成 - 由于依賴于天然ECM的傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)的限制，這種影響以前是未知的。當(dāng)HUVEC被包裹在水凝膠中時(shí)，同樣的觀察結(jié)果可以進(jìn)一步擴(kuò)展到3D細(xì)胞培養(yǎng)。

結(jié)果顯示水凝膠的可調(diào)節(jié)性和機(jī)械強(qiáng)度以及使用VitroGel水凝膠的最佳濃度，培養(yǎng)時(shí)間和3D血管結(jié)構(gòu)形成的影響。我們證明生長(zhǎng)因子不僅存在于培養(yǎng)基中，而且存在于水凝膠本身中，顯著影響管的形成。用無(wú)異源可調(diào)節(jié)的VitroGel水凝膠系統(tǒng)代替天然ECM，研究人員能夠研究微環(huán)境的物理、化學(xué)、生物學(xué)特性與細(xì)胞行為之間的關(guān)系。

簡(jiǎn)而言之，兩種體外水凝膠血管生成試劑盒是研究人員探索血管生成的強(qiáng)大工具。我們希望這些試劑盒能助力研究人員和研究團(tuán)隊(duì)建立復(fù)雜的組織模型，以提升藥物篩選過(guò)程、細(xì)胞侵襲測(cè)定以及內(nèi)皮細(xì)胞和血管生成的疾病相關(guān)研究。

材料和方法

一、細(xì)胞培養(yǎng)

將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）維持在含有10%胎牛血清（FBS）和1x青霉素-鏈霉素抗生素的內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基（EGM）中。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80-90%融合率時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代。

二、調(diào)節(jié)水凝膠性能

✦ 01、研究水凝膠中生長(zhǎng)因子對(duì)血管生成的影響
為了研究水凝膠內(nèi)生長(zhǎng)因子對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和血管生成的影響，將HUVEC與即用型VitroGel AAK試劑盒一起使用。兩種類型的VitroGel AAK添加物可用于直接與VitroGel AAK混合。VitroGel AAK Supplement 1（不含VEGF）用于制備VEGF陰性水凝膠，VitroGel AAK Supplement 2（含VEGF）用于制備VEGF陽(yáng)性水凝膠。為了制備不含額外生長(zhǎng)因子的水凝膠，我們使用VitroGel AAK水凝膠直接與EGM基礎(chǔ)培養(yǎng)基混合（請(qǐng)閱讀VitroGel AAK試劑盒的操作說(shuō)明書以了解詳細(xì)的水凝膠制備）。

✦ 02、研究水凝膠的機(jī)械強(qiáng)度對(duì)血管生成的影響
使用高濃度VitroGel AAK-HC試劑盒調(diào)節(jié)水凝膠的機(jī)械強(qiáng)度。將VitroGel AAK-HC水凝膠與VitroGel AAK稀釋溶液分別以1:0、1:1和1:3（v/v）的比例混合。然后將稀釋的水凝膠混合物與VitroGel AAK添加物混合，以根據(jù)以下方法說(shuō)明制備2D水凝膠包被培養(yǎng)物或3D培養(yǎng)物（請(qǐng)閱讀VitroGel AAK-HC試劑盒的操作說(shuō)明書以了解詳細(xì)的水凝膠制備）。

三、2D水凝膠包被培養(yǎng)
使用胰蛋白酶消化細(xì)胞，然后以0.5 x106細(xì)胞/mL的接種密度重懸于內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基+ 10% FBS中。使用以下步驟（以AAK Supplement 1為例）制備用于細(xì)胞培養(yǎng)的VitroGel AAK和VitroGel AAK-HC水凝膠。

✦ 01、將 1 mL 水凝膠溶液加入 500 μL AAK Supplement 1 中，輕輕上下顛倒 5-10 次以充分混勻。
注意：保持VitroGel AAK溶液和AAK Supplement 1的混合比例為2：1（v / v）。
✦ 02、將 50 μL 水凝膠混合物轉(zhuǎn)移到 96 孔板中。輕輕旋轉(zhuǎn)孔板以確保均勻覆蓋孔底部。
✦ 03、室溫下靜置10-15分鐘以形成軟凝膠。
注意：在此期間，不要搖晃孔板干擾軟凝膠的形成。
✦ 04、小心地將 50 μL 細(xì)胞懸液添加到凝膠頂部。在 37°C 下孵育。
✦ 05、將細(xì)胞在37°C孵育，每隔一天更換50-80%的頂部培養(yǎng)基。
四、3D培養(yǎng)
對(duì)于HUVEC的3D培養(yǎng)，使用VitroGel AAK和VitroGel AAK-HC觀察血管的形成和結(jié)構(gòu)。使用以下步驟制備水凝膠-細(xì)胞混合物（以AAK Supplement 1為例）：

✦ 01、在AAK Supplement 1中制備細(xì)胞懸液。推薦的細(xì)胞濃度為 1-2 x106細(xì)胞/mL。
✦ 02、將 1 mL 水凝膠溶液添加到上一步的 500 μL 細(xì)胞懸液中。輕輕上下顛倒 5-10 次以徹底混勻，將水凝膠和細(xì)胞懸液保持在 2：1 （v/v） 的比例。
✦ 03、將 50 μL 水凝膠混合物轉(zhuǎn)移到 96 孔板中。輕輕旋轉(zhuǎn)孔板以確保均勻覆蓋每個(gè)孔的表面。
✦ 04、室溫下靜置10-15分鐘以形成軟凝膠。
注意：在此期間，不要搖晃孔板干擾軟凝膠的形成。
✦ 05、小心地在孔頂部添加 50 μL 額外培養(yǎng)基以覆蓋水凝膠。
✦ 06、置于37°C的培養(yǎng)箱中孵育，每隔一天更換50-80%的頂部培養(yǎng)基，以免影響培養(yǎng)板中的水凝膠狀態(tài)（或根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)更換覆蓋培養(yǎng)基）。 五、熒光成像
對(duì)于熒光成像，將細(xì)胞固定并用Actin Green和NucBlue染色，以標(biāo)記F-actin以及細(xì)胞核。 詳細(xì)步驟如下：

✦ 01、用移液管小心地移除水凝膠頂部的培養(yǎng)基。
✦ 02、水凝膠用100 μL DPBS洗滌。將洗滌緩沖液留在水凝膠上1分鐘，然后移除。
✦ 03、將100 μL細(xì)胞固定溶液（4%甲醛）加入到水凝膠表面。
✦ 04、孔板置于室溫下孵育15-30分鐘，然后移除固定液。
✦ 05、用 100 μL DPBS 輕輕洗滌水凝膠 3 次，使洗滌緩沖液在兩次洗滌之間靜置1分鐘。
✦ 06、加入 100 μL 0.1% Triton X-100），并在室溫下孵育 5 分鐘。
✦ 07、小心地移除Triton X-100，用100 μL DPBS洗滌孔三次，使洗滌緩沖液在兩次洗滌之間靜置1分鐘。
✦ 08、向水凝膠中加入 100 μL 封閉液（3% BSA的DPBS溶液），并在室溫下孵育 60 分鐘。
✦ 09、去除封閉液，添加ActinGreen 488或DRAQ5 ReadyProbes 試劑（ThermoFisher，按照操作說(shuō)明添加）。
✦ 10、將孔板孵育30分鐘，然后加入NucBlue Fixed Cell Stain Ready Probes試劑（ThermoFisher）。
✦ 11、孔板避光孵育5分鐘并進(jìn)行熒光成像。

六、結(jié)果和討論

在水凝膠表面培養(yǎng)HUVEC。圖1顯示了接種到含有VEGF陽(yáng)性AAK Supplement 2 中培養(yǎng)18小時(shí)的HUVEC血管生成的圖像，VitroGel AAK （左圖）、AAK-HC水凝膠（右圖）。
✦ 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 （HUVEC） 接種在（左圖）VitroGel AAK 水凝膠或（右圖）VitroGel AAK-HC 水凝膠與 AAK Supplement 2中培養(yǎng)18小時(shí)后血管生成的圖像。

✦ 熒光顯微鏡觀察以可視化VitroGel AAK或VitroGel AAK-HC水凝膠上的HUVEC活性和血管生成。圖2顯示了肌動(dòng)蛋白絲的免疫熒光圖像和HUVEC的核酸染色。在這里，我們觀察到大量的肌動(dòng)蛋白絲和核酸，表明水凝膠的巨大活力以及整體血管的形成和形態(tài)。
  圖2. HUVEC細(xì)胞在VitroGel AAK水凝膠（A）/VitroGel AAK-HC水凝膠（B）與AAK Supplement 2上的管狀形態(tài)。將細(xì)胞固定并用DAPI（藍(lán)色）和actin green（綠色）染色。

✦ 當(dāng)使用VEGF陰性添加物（VitroGel AAK Supplement 1）的水凝膠時(shí)，在VitroGel AAK和VitroGel AAK-HC水凝膠的兩種情況下，HUVEC能夠在表面上附著和生長(zhǎng)而不會(huì)形成管（圖3）。圖2和圖3表明，盡管在兩種水凝膠條件下使用了相同的完全培養(yǎng)基，但水凝膠中的VEGF生長(zhǎng)因子會(huì)顯著影響管的形成。 圖3.HUVEC細(xì)胞在VitroGel AAK水凝膠（A）/VitroGel AAK-HC水凝膠（B）與AAK Supplement 1上的生長(zhǎng)形態(tài)。將細(xì)胞固定并用DRAQ5（紅色）和actin green（綠色）染色。

✦ 接下來(lái)，我們旨在比較在補(bǔ)充或不補(bǔ)充生長(zhǎng)因子的情況下制備的VitroGel AAK水凝膠上的HUVEC生長(zhǎng)，以突出生長(zhǎng)因子對(duì)水凝膠血管生成的影響。在該實(shí)驗(yàn)中，在水凝膠頂部使用相同的完整內(nèi)皮生長(zhǎng)培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。在圖4的不同時(shí)間點(diǎn)獲得具有VitroGel AAK Supplement 2或不含生長(zhǎng)因子的水凝膠頂部的HUVEC細(xì)胞生長(zhǎng)。圖4B和4D顯示了在水凝膠表面上生長(zhǎng)的細(xì)胞，其中不含生長(zhǎng)因子添加物，而圖4A和4C顯示了給予VitroGel AAK-Supplement 2的細(xì)胞的圖像。

有趣的是，盡管在兩種培養(yǎng)條件下都使用了完整的細(xì)胞培養(yǎng)基，但與未從水凝膠中補(bǔ)充生長(zhǎng)因子的細(xì)胞相比，延時(shí)視頻顯示，添加細(xì)胞生長(zhǎng)因子后，水凝膠中的細(xì)胞附著和血管生成有顯著改善。

這些圖像為水凝膠添加物對(duì)HUVEC增殖和活力的益處提供了進(jìn)一步的證據(jù)，因?yàn)榕c接受水凝膠生長(zhǎng)因子支持的細(xì)胞相比，沒(méi)有補(bǔ)充生長(zhǎng)因子的細(xì)胞清楚地顯示出更少的管腔結(jié)構(gòu)（圖4D紅色箭頭）。 圖4.有和沒(méi)有生長(zhǎng)因子添加物的VitroGel AAK水凝膠頂部?jī)?nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的比較。左上）實(shí)時(shí)視頻顯示HUVEC接種在含有VEGF的AAK Supplement 2中培養(yǎng)18小時(shí)的血管生成圖；右上）實(shí)時(shí)視頻顯示沒(méi)有細(xì)胞生長(zhǎng)因子的HUVEC接種；C）HUVEC細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)在具有AAK Supplement 2的VitroGel AAK水凝膠頂部生長(zhǎng)；D）沒(méi)有細(xì)胞生長(zhǎng)因子的不同時(shí)間點(diǎn)的HUVEC細(xì)胞生長(zhǎng)。紅色箭頭表示管狀結(jié)構(gòu)形成。

✦ 對(duì)于VitroGel AAK-HC水凝膠的研究，我們旨在提供基質(zhì)的機(jī)械性能如何影響HUVEC血管生成的新方案。因此，我們制備了不同濃度的水凝膠，以實(shí)現(xiàn)水凝膠基體的各種機(jī)械強(qiáng)度。VitroGel AAK Supplement 2用于制備所有水凝膠，以消除生長(zhǎng)因子對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，以專注于機(jī)械性能的影響。這些分析的結(jié)果如圖5所示。
更強(qiáng)的水凝膠機(jī)械強(qiáng)度（即較低的稀釋比，例如1:0）導(dǎo)致血管生成減少，因?yàn)榧?xì)胞更容易聚集導(dǎo)致細(xì)胞死亡。與較軟的水凝膠混合物（如 1:1 稀釋或 1:3 稀釋）相比，1:0 稀釋比例的管結(jié)構(gòu)形成明顯減少。特別是，在血管生成后，1:0稀釋水凝膠表面上的細(xì)胞在大約12小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)開始聚集并形成細(xì)胞球狀體。在16:1稀釋的1小時(shí)時(shí)間點(diǎn)觀察到類似的觀察結(jié)果，而對(duì)于最柔軟的水凝膠（1:3稀釋），細(xì)胞能夠附著在水凝膠表面并在18小時(shí)逐漸形成管結(jié)構(gòu)。
水凝膠的理想情況應(yīng)該是它幫助細(xì)胞適應(yīng)特定物質(zhì)的能力，并最終使細(xì)胞能夠很好地?cái)U(kuò)散并附著在基質(zhì)上，最終誘導(dǎo)血管生成。總體而言，這些數(shù)據(jù)表明高機(jī)械強(qiáng)度對(duì)于管結(jié)構(gòu)的形成和血管生成特性并不是最佳的。同樣，這些數(shù)據(jù)表明，較軟的水凝膠濃度在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)為細(xì)胞附著和活力提供了更好的支持。 圖5 水凝膠機(jī)械強(qiáng)度對(duì)血管生成的影響
在水凝膠表面培養(yǎng)HUVEC。圖1顯示了接種到含有VEGF陽(yáng)性AAK Supplement 2 中培養(yǎng)18小時(shí)的HUVEC血管生成的圖像，VitroGel AAK （左圖）、AAK-HC水凝膠（右圖）。

應(yīng)用中描述的數(shù)據(jù)為無(wú)異源水凝膠血管生成試劑盒 VitroGel Angiogenesis Assay Kits 作為HUVEC 細(xì)胞 2D 水凝膠包被和 3D 培養(yǎng)研究工具的實(shí)用性提供了證據(jù)。

這些數(shù)據(jù)表明，水凝膠中的生長(zhǎng)因子（例如VEGF）會(huì)顯著影響血管的形成。同樣，水凝膠濃度本身對(duì)于生長(zhǎng)，增殖和血管生成也很重要，因?yàn)榫哂休^高機(jī)械強(qiáng)度的水凝膠導(dǎo)致血管生成大大減少，而較軟的水凝膠促進(jìn)這種生長(zhǎng)。

總之，水凝膠血管生成試劑盒 VitroGel Angiogenesis Assay Kits  可以精確地模擬體內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞微環(huán)境，血管生成的細(xì)胞-細(xì)胞間和細(xì)胞-環(huán)境間的相互作用。我們希望這些工具可以助力研究人員探索血管生成過(guò)程的更全面的機(jī)制，以及建立組織模型，用于藥物篩選、細(xì)胞侵襲和癌癥研究等應(yīng)用。