Octet® 非標(biāo)記分子互作儀在甲流基礎(chǔ)研究及藥物研發(fā)中的應(yīng)用

正值流感高發(fā)季節(jié)，近期全國(guó)各地均出現(xiàn)了不同程度的群體性感染。 流感主要流行期為12月至次年3月，相較于普通感冒，流感的傳染性更強(qiáng)，傳播速度快，且癥狀更重，多伴有高熱（≥38℃）、咽痛、咳嗽和肌肉酸痛等全身癥狀。季節(jié)性流行的流感多為甲型流感病毒中的H1N1和H3N2亞型，病毒顆粒呈球狀，直徑為80-120nm，囊膜上有許多突起糖蛋白，分別是血凝素HA、神經(jīng)氨酸酶NA和M1/M2蛋白。
 

圖1. 流感病毒結(jié)構(gòu)圖：外圍標(biāo)注的是結(jié)構(gòu)蛋白，內(nèi)部標(biāo)注的是攜帶的非結(jié)構(gòu)蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白的基因。

在甲流的基礎(chǔ)研究以及藥物研發(fā)方面，賽多利斯基于生物層干涉技術(shù)的Octet® 非標(biāo)記分子互作儀擁有非常多CNS積累的案例，能夠?yàn)榭茖W(xué)研究提供新的洞察！
 
 
Octet® 在甲流侵染機(jī)制中的應(yīng)用

流感病毒識(shí)別的是一類(lèi)在動(dòng)物細(xì)胞表面廣泛存在的多糖，禽類(lèi)受體是α2’3-唾液酸，而人類(lèi)受體是α2’6-唾液酸，禽流感病毒能夠感染人類(lèi)，就是因?yàn)榱鞲胁《颈砻娴鞍装l(fā)生了突變，其結(jié)合的受體從禽類(lèi)受體向人受體轉(zhuǎn)變導(dǎo)致。2013年，H7N9在中國(guó)華東地區(qū)爆發(fā)，掀起了流感病毒的研究的新一輪熱潮。當(dāng)年的一篇NATURE文章就用實(shí)例證明了Octet®  是檢測(cè)流感病毒受體親和力的神器[1]。
 

之所以稱(chēng)為“神器”，因?yàn)檫@篇NATURE文獻(xiàn)作者發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表面的受體密度與固化在Octet® 的鏈霉親和素傳感器上的受體密度非常相似，所以是非常好的研究流感病毒與其受體親和力的工具，而且可以直接將病毒而不是表面蛋白作為分析物。只需要將受體多糖在鏈霉親和素傳感器上固化成不同密度，結(jié)合同一濃度（100pM）的流感病毒，以固化密度（信號(hào)大�。┖徒Y(jié)合信號(hào)作圖，就可以評(píng)估受體和病毒的結(jié)合活性。
 

圖2. 曲線上升的越快，則說(shuō)明親和力越高。比如X-31型流感病毒,其對(duì)人受體的親和力比禽類(lèi)受體的要強(qiáng)。
 
由于多重結(jié)合等復(fù)雜因素，流感病毒顆粒結(jié)合受體后不能有效洗脫，固化受體的探測(cè)器表面的重生很難獲得實(shí)現(xiàn)。生物層干涉（BLI）技術(shù)單個(gè)探針的成本相對(duì)較低，使得我們可以以較低成本廣泛測(cè)試獲得最優(yōu)的檢測(cè)條件，優(yōu)化后的條件具有較高的實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)度，可以實(shí)現(xiàn)橫向?qū)Ρ炔煌�毒株的結(jié)合能力。幫助我們?cè)诹鞲胁《镜氖荏w結(jié)合、抗體結(jié)合方面做出一系列的工作。

作者簡(jiǎn)介

熊曉犁博士
中科院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院研究員
 2011年博士畢業(yè)于布里斯托大學(xué)細(xì)胞與分子醫(yī)學(xué)系，博士畢業(yè)后師從皇家學(xué)會(huì)副會(huì)長(zhǎng)流感病毒專(zhuān)家John Skehel爵士進(jìn)行流感病毒的研究，運(yùn)用X射線晶體學(xué)的方法率先解析了感染人類(lèi)的禽流感毒株如H5N1，H7N9，H10N8的凝血素與受體形成的復(fù)合物的結(jié)構(gòu)特征，并使用Biolayer Interferometry（生物層干涉）的方法測(cè)量了活病毒與人類(lèi)和禽類(lèi)受體分別的結(jié)合能力。作為第一作者，這一系列工作成果被Nature（3篇），PNAS（1篇），Virology （1篇），Virus Research（1篇）雜志分別發(fā)表。詳細(xì)信息
 
這種方法最真實(shí)的反應(yīng)出人體環(huán)境中的病毒結(jié)合能力，所以自從這種方法建立成功后，便得到了廣泛的應(yīng)用，多篇文獻(xiàn)（含多篇CNS）也使用了這個(gè)方法來(lái)研究甲流病毒的進(jìn)化[2-8]。比如下面的一些發(fā)現(xiàn)：
 

圖3.Octet® 數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)2001年以來(lái)H3N2型流感對(duì)人受體親和力在下降，可能與近10年來(lái)H3N2導(dǎo)致疾病的嚴(yán)重程度下降相關(guān)[2]。
 

圖4. Octet® 發(fā)現(xiàn)可以感染人類(lèi)的H5型病毒完全去除了與禽受體的結(jié)合能力，保留了與人受體結(jié)合能力，H7型病毒對(duì)兩者的結(jié)合能力相當(dāng)。而H3型保留了兩者的結(jié)合能力，對(duì)人受體結(jié)合更強(qiáng)[3]。
 
 
Octet® 在藥物研發(fā)領(lǐng)域中的應(yīng)用（基于受體配體競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)）

研究機(jī)理的目的是應(yīng)用，只要在前述方法基礎(chǔ)上，在病毒中混入抑制劑，后與受體相互作用，便可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)檢測(cè)抑制劑的藥效[9-11]。
 

圖5. Octet® 將多糖受體固化在傳感器上，與小分子抑制劑和流感病毒的混合物反應(yīng)發(fā)現(xiàn)，抑制劑可以部分阻斷病毒和受體的結(jié)合[11]。
 

圖6. Octet® 發(fā)現(xiàn)抗體抑制劑FLD194可以阻斷病毒與人受體和禽受體的結(jié)合[12]。

固化了多糖受體的傳感器還可以再生重復(fù)使用，達(dá)到降低使用成本的目的[11]！
 

圖7. 只要在病毒緩沖液中加入奧司他韋（OC），阻止病毒NA蛋白對(duì)多糖的剪切作用，就可以用酸性溶液洗掉病毒進(jìn)行再生。
   
當(dāng)然，還有很多使用Octet® 進(jìn)行基于小分子藥物[13,14]、抗體藥物[15-20]和流感靶點(diǎn)親和力測(cè)試的案例，這里就不一一列舉了。

10年來(lái)，已經(jīng)有近40篇使用Octet® 直接檢測(cè)流感病毒與多糖受體親和力的文獻(xiàn)發(fā)表，并在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行了藥物的開(kāi)發(fā)。真金不怕火煉，一次次的被選擇真正說(shuō)明Octet® 是檢測(cè)流感病毒與其受體的神器！
 
 
最后提醒大家:

如果得了流感：需要多休息，多喝水，流感為自限性疾病，休息期間避免前往人員聚集的地方。如自覺(jué)癥狀有所加重，建議佩戴好口罩前往就近的發(fā)熱門(mén)診就診，根據(jù)醫(yī)囑服用抗流感病毒藥物。對(duì)于新冠的預(yù)防措施對(duì)于流感預(yù)防同樣有效：勤洗手、正確洗手，做好手衛(wèi)生。保持環(huán)境清潔和通風(fēng)。保持良好的呼吸道衛(wèi)生習(xí)慣，咳嗽或打噴嚏時(shí)，用上臂內(nèi)側(cè)或紙巾、毛巾等遮蔽住口鼻。重點(diǎn)人群建議每年接種流感疫苗。
 
 
 
下載文檔

下載《病毒學(xué)基礎(chǔ)研究及藥物研發(fā)應(yīng)用文集》，了解病毒學(xué)及病毒與免疫系統(tǒng)互作研究的前沿理論與技術(shù)。

-參考文獻(xiàn)-
[1]Receptor binding by a ferret-transmissible H5 avian influenza virus.nature,2013
[2]Evolution of the receptor binding properties of the influenza A(H3N2) hemagglutinin. www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1218841110
[3]Receptor binding by an H7N9 influenza virus from humans. doi:10.1038/nature12372
[4]Preferential recognition of avian-like receptors in human influenza A H7N9 viruses. Science. 2013 December 6; 342(6163): 1230–1235
[5]Recent evolution of equine influenza and the origin of canine influenza. www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1406606111
[6]Changes in the hemagglutinin of H5N1 viruses during human infection – Influence on receptor binding. Virology 447(2013)326–337
[7]Enhanced human receptor binding by H5 haemagglutinins. Virology456-457(2014)179–187
[8]Receptor binding by H10 influenza viruses. doi:10.1038/nature13443
[9]Biophysical Measurement of the Balance of Influenza A Hemagglutinin and Neuraminidase [10]Activities. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 290, NO. 10, pp. 6516–6521
[11]Preventing Influenza A Virus Infection by Mixed Inhibition of Neuraminidase and Hemagglutinin by Divalent Inhibitors. J. Med. Chem. 2022, 65, 7312−732
[12]Structures of complexes formed by H5 influenza hemagglutinin with a potent broadly neutralizing human monoclonal antibody。Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 July 28; 112(30): 9430–9435.
[13]Structure-based optimization and synthesis of antiviral drug Arbidol analogues with significantly improved affinity to influenza hemagglutinin. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters，2017
[14]A Potent Anti-influenza Compound Blocks Fusion through Stabilization of the Prefusion Conformation of the Hemagglutinin Protein. Infectious Diseases,2015
[15]A Highly Conserved Neutralizing Epitope on Group 2 Influenza A Viruses.Science,2013
[16]Unique structural solution from a VH3-30 antibody targeting the hemagglutinin stem of influenza A viruses. NATURE COMMUNICATIONS | (2021) 12:559
[17]Influenza Infection in Humans Induces Broadly Cross-Reactive and Protective Neuraminidase- Reactive Antibodies. Cell
[18]Viral Receptor-Binding Site Antibodies with Diverse Germline.Cell
[19]A stable trimeric influenza hemagglutinin stem as a broadly protective immunogen. SCIENCE,2015
[20]Optimization of affinity, specificity and function of designed influenza inhibitors using deep sequencing. nature biotechnology