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熒光超分辨顯微術(shù)淺析與活細(xì)胞超分辨成像新進(jìn)展

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本文作者：錢佳銘博士
南京理工大學(xué)智能計(jì)算成像實(shí)驗(yàn)室

光學(xué)顯微鏡

光學(xué)顯微鏡（optical microscopy），顧名思義，是通過光學(xué)手段將人眼所不能分辨的微小物體放大成像，以供人們提取微細(xì)結(jié)構(gòu)的光學(xué)儀器。如今，光學(xué)顯微鏡已發(fā)展成為許多基礎(chǔ)研究和工程應(yīng)用中的核心技術(shù)，廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、生物學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)、材料科學(xué)、納米技術(shù)、工業(yè)檢測、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域，為人類的發(fā)展做出了不可磨滅的重大貢獻(xiàn)。

早在三百多年前，人類就已經(jīng)使用光學(xué)顯微鏡觀察肉眼無法分辨的微觀物體。1662年，英國物理學(xué)家羅伯特·胡克（Robert Hooke，1635—1703年）使用自制的顯微鏡觀察軟木切片，發(fā)現(xiàn)其在放大后呈現(xiàn)出類似修道院單人居室的微觀結(jié)構(gòu)，并以拉丁語“Cella”（“細(xì)胞”英文單詞“Cell”的由來）命名這些結(jié)構(gòu)，意為“小房間”或“小隔間”。這是人類歷史上第一次觀察到細(xì)胞。

圖1 胡克所著關(guān)于顯微鏡的首本書籍《顯微圖譜》（Micrographia）。(a) 《顯微圖譜》封面。(b) 胡克觀察到的軟木微觀結(jié)構(gòu)，并將其命名為“Cella”。(c) 胡克改進(jìn)的復(fù)式顯微鏡。(d) 胡克觀察到的跳蚤圖像

3年后，胡克記錄了使用顯微鏡進(jìn)行的各種觀察并出版了首部關(guān)于顯微鏡的著作——《顯微圖譜》（Micrographia）（圖1），書中包含大量繪制精美的動、植物機(jī)體微觀結(jié)構(gòu)圖像，開創(chuàng)了科學(xué)界利用圖畫方式進(jìn)行交流的先河。《顯微圖譜》的出版使人們意識到微觀世界和宏觀世界一樣豐富多彩，其中有許多未知的奧秘等待著被探索。同一時期，荷蘭商人列文虎克（Antoni van Leeuwenhoek，1632—1723年）制造出當(dāng)時“最強(qiáng)”的光學(xué)顯微鏡，可實(shí)現(xiàn)300倍放大率，并持續(xù)“稱霸”了一個多世紀(jì)。

1676年春天，在用顯微鏡對雨水進(jìn)行持續(xù)幾天的觀察后，列文虎克發(fā)現(xiàn)水中有很多在活動的小生命，并給英國皇家學(xué)會寄去了包含這些發(fā)現(xiàn)的信件，其中有這樣一段話：“我判斷，即使把一百個這些小動物撐開擺在一起，也不會超過一顆粗沙子的長度；如果這是真的，那么一百萬個這些活物也不夠一顆粗沙粒的體積。”這段文字中的“小動物”，就是我們現(xiàn)在熟知的細(xì)菌（圖2）。這是人類首次發(fā)現(xiàn)活體細(xì)菌，并由此開創(chuàng)了微生物學(xué)，為人類對生物學(xué)和顯微鏡的研究開啟了一個新時代。

圖2 列文虎克制作的顯微鏡及記錄手稿。(a) 列文虎克制作的顯微鏡，先存于烏得勒支大學(xué)博物館。(b) 列文虎克繪制的細(xì)菌。(c) 列文虎克寄給英國皇家學(xué)會的書信之一

隨后，光學(xué)顯微技術(shù)經(jīng)歷了不斷的革新，以越來越高的分辨率與成像質(zhì)量，引導(dǎo)人類向無盡的微觀世界發(fā)起無窮的探索（圖3）。特別是上世紀(jì)以來，隨著人類對生命現(xiàn)象本質(zhì)研究的逐漸深入，生命科學(xué)涉及問題的日益深化，檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)對快速準(zhǔn)確檢測手段需求的不斷提高，光學(xué)顯微技術(shù)得到了突飛猛進(jìn)的發(fā)展。

圖3 不同時期的奧林巴斯顯微鏡。依次為1920年“旭號”顯微鏡、1927年“昭和號”顯微鏡、1980年“BH2”系列顯微鏡、1983年“AH2”系列顯微鏡、1993年“BX”系列顯微鏡、1996年“MX50”顯微鏡、“IX3”系列研究型倒置顯微鏡、IXplore spinSR超分辨共聚焦顯微鏡

超分辨熒光顯微成像技術(shù)

1873年，德國物理學(xué)家恩斯特·阿貝（Ernst Karl Abbe，1840—1905年）提出了光學(xué)成像系統(tǒng)的衍射極限理論，指出光學(xué)顯微鏡的分辨率極限大約是可見光波長的一半（約200nm），這被稱為“阿貝極限”^1,2。該問題困擾著科學(xué)家長達(dá)一個世紀(jì)之久，這一時期光學(xué)顯微鏡的應(yīng)用一直被限制在細(xì)胞水平而無法在亞細(xì)胞層面進(jìn)行高分辨成像。

21世紀(jì)初，受激發(fā)射損耗顯微術(shù)³（stimulated emission depletion，STED）、結(jié)構(gòu)光照明顯微術(shù)⁴（structured illumination microscopy，SIM）、單分子定位顯微術(shù)^5,6（photoactivated localization microscopy/stochastic optical reconstruction microscopy，PALM/STORM）等超分辨成像技術(shù)繞開了百余年來似乎一直被認(rèn)為是無法突破的阿貝衍射極限，在納米尺度至單分子水平可視化生物分子，以前所未有的時空分辨率探究活細(xì)胞結(jié)構(gòu)和動態(tài)過程，成為生命科學(xué)研究中不可或缺的重要工具。

2014年，諾貝爾化學(xué)獎授予Eric Betzig，Stefan W. Hell和William E. Moerner三位科學(xué)家，以表彰他們對超分辨熒光顯微成像技術(shù)的重大貢獻(xiàn)，再一次展現(xiàn)了該技術(shù)在人類發(fā)展歷程中以及未來發(fā)展方向上的重要地位⁷。

圖4 2014年，諾貝爾化學(xué)獎授予Eric Betzig，Stefan W. Hell和William E. Moerner三位科學(xué)家，以表彰他們對超分辨率熒光顯微成像技術(shù)的重大貢獻(xiàn)

· 單分子定位的顯微術(shù)

在基于單分子定位的超分辨顯微成像技術(shù)中，PALM由2014年諾貝爾獎得主之一Betzig⁸提出，該技術(shù)基于熒光分子的光轉(zhuǎn)化能力和單分子定位，通過用光控制每次僅有少量隨機(jī)離散的單個熒光分子發(fā)光，并準(zhǔn)確定位單個熒光分子點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的中心，最終利用多次曝光疊加成一幅超高分辨率圖像（圖5）。

由Hess⁹提出的熒光活化定位顯微術(shù)（fluorescence photoactivation localization microscopy, fPALM）與PLAM原理相似，熒光團(tuán)經(jīng)探測器成像后，由光強(qiáng)控制熒光分子被可逆地滅活或不可逆地光漂白而從視場中消失。由Zhuang等¹⁰提出的STORM技術(shù)與PALM技術(shù)在原理上類似，其利用化學(xué)小分子Cy3和Cy5、Cy7等熒光分子對的光轉(zhuǎn)換效應(yīng)同樣可以達(dá)到突破光學(xué)極限的效果。與PALM區(qū)別在于其所利用的探針是化學(xué)小分子而不是生物大分子。因此，STORM需要利用熒光發(fā)色團(tuán)標(biāo)記抗體對靶蛋白進(jìn)行識別，可以檢測到內(nèi)源性蛋白，避免PALM中由于外源性表達(dá)偶聯(lián)熒光蛋白的靶蛋白對其定位產(chǎn)生的可能的影響。2014年，三個小組分別報(bào)道了互補(bǔ)式可激活型熒光蛋白系統(tǒng)，在哺乳動物（PAGFP¹¹和PAmCherry¹²）和大腸桿菌中（mEos3.2¹³）實(shí)現(xiàn)了熒光互補(bǔ)和超高分辨率成像，對二聚化或相互作用蛋白的超高分辨率成像具有重要應(yīng)用價(jià)值�；趩畏肿佣ㄎ坏某直骘@微成像技術(shù)可實(shí)現(xiàn)10~30nm的橫向分辨率，但由于反復(fù)激活和淬滅熒光分子，所需時間長，其時間分辨率較低。

圖5 PALM原理示意圖與結(jié)果圖。(a)-(c) PALM原理示意圖，其中圖(a)為探測的單個原始光子圖像，圖(b)對對圖(a)的高斯擬合，圖(c)為定位的圖(a)的中心。(d) 聚苯乙烯微球的寬場圖像。(e) 疊加原始PALM堆棧數(shù)據(jù)中單分子圖像所獲取的聚苯乙烯微球圖像。(f) 聚苯乙烯微球的PALM超分辨圖像

· 受激發(fā)射損耗顯微術(shù)

STED是一種基于點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)調(diào)制的超分辨技術(shù)，其最早由2014年諾貝爾獎得主之一Hell^14–16提出。STED采用兩束共軸激光，分別為激發(fā)光和損耗光。在激發(fā)光的照射下，基態(tài)的熒光分子吸收光子躍遷到激發(fā)態(tài)并發(fā)射出熒光；再使用環(huán)形損耗光將第1束光斑周圍的熒光物質(zhì)通過受激損耗過程滅活，只保留位于中間部位的納米尺度區(qū)域以減少熒光光點(diǎn)的衍射面積，通過掃描記錄即可獲取整個樣品的完整圖像¹⁷。STED顯微鏡的橫向分辨率可達(dá)20~70nm，憑借超高的分辨率，STED很快被應(yīng)用于生物細(xì)胞研究并取得一系列重要的新發(fā)現(xiàn)¹⁷。

但是，由于STED本身屬于點(diǎn)掃描成像技術(shù)，為了提升成像速度，STED通常需要高的激發(fā)強(qiáng)度（~10⁷W/cm²）來記錄足夠的光子以換取時間分辨率，所導(dǎo)致的光毒性和光漂白限制了STED在活細(xì)胞成像中的應(yīng)用。

圖6 STED的超分辨原理示意圖和結(jié)果圖16。(a) STED典型光學(xué)系統(tǒng)。(b) STED超分辨原理。(c) 微管寬場圖

像。(d) 微管STED超分辨圖像

· 結(jié)構(gòu)光照明顯微術(shù)

另一種典型的基于點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)調(diào)制的超分辨技術(shù)是SIM技術(shù)。如前所述，成像系統(tǒng)的分辨率受到阿貝衍射極限的限制，存在接近波長一半尺度的衍射極限，物場信息中高于此光學(xué)傳遞函數(shù)截止頻率的成分將會被濾除。針對這一問題，Gustafsson¹⁸于2000年提出了SIM技術(shù)，其基本原理是通過結(jié)構(gòu)化照明在頻域以空間混頻的方式將物體高頻信息載入光學(xué)系統(tǒng)的探測通帶內(nèi)實(shí)現(xiàn)突破阿貝衍射極限的超分辨光學(xué)顯微成像。當(dāng)利用周期性結(jié)構(gòu)正弦照明光激發(fā)樣品時，在頻域上由于結(jié)構(gòu)光頻譜與物頻譜的卷積而產(chǎn)生攜帶物體信息的多級頻譜。其中±1級頻譜將攜帶物體細(xì)節(jié)信息的高頻部分平移至截止頻率范圍內(nèi)而被探測，如圖7所示。但這些高頻信息與0級頻譜的低頻信息疊加在一起，需要后期數(shù)據(jù)處理（如相移、反卷積、參數(shù)估計(jì)等）將三級頻譜分開才能有效獲得樣品的高頻信息¹⁹。由于結(jié)構(gòu)光條紋照射在樣品上也受到系統(tǒng)衍射限制，因此等效截止頻率最多可拓展一倍，即SIM的分辨率最多能在衍射極限基礎(chǔ)上提高一倍，達(dá)到非相干衍射極限的2倍，約在100nm²⁰。盡管SIM對橫向分辨率的提升不如PALM、STORM、STED等技術(shù)，但其高的光子效率、較快的成像速度和全場成像等優(yōu)點(diǎn)使得其非常適合進(jìn)行活細(xì)胞的超分辨成像。值得注意的是，光柵衍射效應(yīng)不僅僅限于±1級頻譜，例如矩形光柵的頻譜就要豐富得多，其還包括±2級、±3級等高階頻譜。

因此，假如能采用矩形光柵作為結(jié)構(gòu)光，則可以產(chǎn)生多級頻譜，使等效截止頻率得到多次拓展從而大幅提高分辨率。但由于結(jié)構(gòu)光的產(chǎn)生也受到光學(xué)系統(tǒng)有限孔徑的限制，直接在物平面上形成一個周期接近衍射極限分辨率的矩形光柵并不現(xiàn)實(shí)。針對此問題，Gustafsson²¹在傳統(tǒng)SIM的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提出了飽和結(jié)構(gòu)光照明顯微技術(shù)（saturated SIM，SSIM），巧妙地利用熒光分子的飽和激發(fā)使樣品在正弦光波激發(fā)下發(fā)出具有高階頻率分量的非正弦結(jié)構(gòu)光，從而實(shí)現(xiàn)多級頻譜拓展[如圖7(b)]，將分辨率提高到了約50nm的水平。然而飽和照明所需的高強(qiáng)度激光增加了SSIM的光毒性與光漂白，無法發(fā)揮SIM高光子效率、低光損傷的優(yōu)勢，使其難以運(yùn)用于活細(xì)胞成像，因此并未得到廣泛應(yīng)用。

圖7 SIM的超分辨原理示意圖及超分辨結(jié)果。(a) 線性結(jié)構(gòu)光照明顯微術(shù)的光路及頻譜調(diào)制過程。(b) 飽和結(jié)構(gòu)光照明顯微技術(shù)的頻譜調(diào)制過程。(c) COS-7細(xì)胞中f-肌動蛋白的飽和SIM超分辨圖像及不同方法的對比結(jié)果（左上：寬場，右上：反卷積，左下：SIM，右下：SSIM）。(d) 不同方法下COS-7細(xì)胞中質(zhì)膜微囊的超分辨圖像（左上：寬場，右上：反卷積，左下：SIM，右下：SSIM）。(e) 活體COS-7細(xì)胞中質(zhì)膜微囊的SSIM超分辨結(jié)果^18,21,22

實(shí)時活細(xì)胞超分辨顯微成像

在上述超分辨成像技術(shù)中，SIM具有寬視場、快速成像、光漂白和光毒性弱以及對熒光染料的非特異性需求等獨(dú)特優(yōu)勢，因此特別適合于活細(xì)胞的長時程超分辨成像^23–25。盡管有著諸多優(yōu)勢，SIM仍然受到一些技術(shù)上的挑戰(zhàn)，其高質(zhì)量超分辨圖像的數(shù)值重建很大程度上依賴于對照明參數(shù)的精確估計(jì)，這些參數(shù)的微小誤差會對重建結(jié)果產(chǎn)生重大影響，導(dǎo)致干擾定量的重建偽影^26,27。此外，“變化多端”的照明參數(shù)對實(shí)驗(yàn)環(huán)境極為敏感，除非嚴(yán)格保持成像條件穩(wěn)定，否則需要在每幀超分辨圖像重建前從獲取的原始觀測數(shù)據(jù)中進(jìn)行逐幀的照明參數(shù)提取^28,29。目前最廣泛使用的基于迭代互相關(guān)（iterative cross-correlation method, COR）的參數(shù)估計(jì)法通過實(shí)空間相位梯度形式的亞像素優(yōu)化提取高精度的照明參數(shù)（波矢、初相位、調(diào)制度）³⁰。然而，COR的性能受到維持活細(xì)胞長期成像所需的低光漂白和光毒性的嚴(yán)苛成像條件所導(dǎo)致的低信噪比的影響，且復(fù)雜耗時的迭代優(yōu)化過程大大降低了SIM的圖像重建效率，對快速、實(shí)時、長時程、無偽影的活細(xì)胞動態(tài)超分辨成像構(gòu)成了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。

近日，來自南京理工大學(xué)的陳錢、左超教授課題組提出一種高效、魯棒的基于主成分分析的結(jié)構(gòu)光照明顯微技術(shù)（PCA-SIM），首次實(shí)現(xiàn)了在有外界干擾的復(fù)雜、低信噪比實(shí)驗(yàn)環(huán)境下對照明參數(shù)的快速自適應(yīng)精準(zhǔn)補(bǔ)償和對活細(xì)胞精細(xì)結(jié)構(gòu)的實(shí)時、高質(zhì)量動態(tài)超分辨成像³¹。他們發(fā)現(xiàn)，理想無干擾條件下的結(jié)構(gòu)光照明相量矩陣應(yīng)是一個秩-1矩陣，其僅包括一個“主成分”，在最小二乘意義上描述了相量矩陣處于一個單一維度的“特征子空間”。然而，由于噪聲、光學(xué)像差、樣品非均勻調(diào)制度等干擾因素，通常情況下實(shí)驗(yàn)上所獲得的相量矩陣會存在不規(guī)則的高維分量。如何消除這些高維干擾分量以獲得對應(yīng)理想照明相量矩陣中單一“主成分”，將是低信噪比條件下進(jìn)行SIM準(zhǔn)確參數(shù)估計(jì)的關(guān)鍵。

圖8 基于主成分分析的結(jié)構(gòu)光照明顯微技術(shù)流程圖。(a) 原始SIM圖像及分離的三個頻譜成分。(b) 被整像素頻移的1級頻譜。(c1) 對圖b逆傅里葉變換所得頻譜的相位圖。(c2) 圖c1中藍(lán)色方框區(qū)域的相位圖。(c3) 圖c2的理想形式。(c4) 圖c3的絕對相位（歸一化為-π到π）。亞像素波矢表現(xiàn)為理想相位的斜率，但其湮沒于各種干擾導(dǎo)致的嚴(yán)重噪聲中。(d) 從頂部至底部依次為：原始相位，使用掩蔽算子后的相位，使用PCA后的相位，最小二乘法擬合后的相位。使用掩膜算子和PCA后，原始相位中的不相關(guān)成分被有效地去除，“凈化”后的相位分布接近于理想形式。(e) 從底部至頂部依次為：獲取的亞像素精度的波矢及合成的超分辨頻譜

主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）是最重要的數(shù)據(jù)降維方法之一，其利用正交變換把由線性相關(guān)變量表示的原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換到少數(shù)幾個由線性無關(guān)變量表示的低維度子空間上，稱為主成分。這恰恰與前面所述的從相量矩陣中準(zhǔn)確估計(jì)照明參數(shù)所要完成的任務(wù)不謀而合。因此，研究人員利用PCA的“降維”特性，將實(shí)驗(yàn)采集到的照明相量矩陣中的干擾成分剔除，以提取由照明參數(shù)主導(dǎo)的“第一主成分”，從根本上消除了影響照明參數(shù)精確估計(jì)的干擾項(xiàng)，從而以簡單高效的方式精準(zhǔn)識別亞像素精度的波矢量與初相位（圖8）。研究人員進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，理想照明相量矩陣的離散傅里葉逆變換本質(zhì)上是一個中心能量集中的狄利克雷（Dirichlet）函數(shù)。這種信號的高度局域化啟發(fā)研究人員在頻譜域中引入一種雙窗掩膜算子，在進(jìn)一步抑制噪聲干擾的同時，將PCA的運(yùn)算量減少約兩到三個量級，極大改善了照明參數(shù)估計(jì)的計(jì)算效率、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。高精度、非迭代重建、魯棒的抗噪性和較低的運(yùn)算量使PCA-SIM為快速、長時程、無偽影的活細(xì)胞超分辨成像開辟了一條新途徑。

圖9 研究人員基于奧林巴斯IX73倒置熒光顯微鏡自主搭建的三色干涉式SIM超分辨儀器示意圖。激發(fā)光通過一系列二向色鏡與反射鏡由空間濾波器擴(kuò)束準(zhǔn)直，照射在顯示高頻光柵圖像的空間光調(diào)制器上并發(fā)生衍射，±1級衍射光通過顯微物鏡在樣品表面發(fā)生干涉，激發(fā)出的熒光通過物鏡與二向色鏡被相機(jī)接收

研究者基于PCA-SIM實(shí)現(xiàn)了對活體COS-7細(xì)胞線粒體的實(shí)時超分辨成像，依靠的平臺是基于奧林巴斯IX73倒置熒光顯微鏡自主搭建的三色干涉式SIM超分辨儀器（圖9）。圖10給出了部分實(shí)時觀測的活體COS-7細(xì)胞的線粒體動態(tài)小管事件（mitochondrial dynamic tubulation，MDT）。如圖10(a)-10(b)，細(xì)長且高度動態(tài)的MDT小管從線粒體中不斷延伸，并與其他線粒體發(fā)生融合，形成了兩個線粒體之前的膜橋。隨后MDT小管逐漸增厚并趨于穩(wěn)定，最終構(gòu)成線粒體網(wǎng)絡(luò)。這些實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象對研究線粒體網(wǎng)絡(luò)的形成以及線粒體功能（如線粒體DNA完整性、細(xì)胞凋亡等）的維持具有重要意義。PCA-SIM為研究活細(xì)胞中納米尺度結(jié)構(gòu)演化、細(xì)胞器互作和生物分子動力學(xué)信息提供了一種快速實(shí)時、靈活便捷、低光損傷的成像新手段，在生命科學(xué)、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

圖10 在不同時間點(diǎn)對COS-7細(xì)胞線粒體的實(shí)時超分辨重建結(jié)果。其中線粒體通過MitoTrackerTMGreen FM標(biāo)記。(a), (d) 寬場圖像和PCA-SIM獲得的超分辨圖像。原始圖像通過原始圖像通過60X 1.42NA物鏡（UPlanXApo 60X 1.42 Oil）獲取。(b), (c) 圖a中藍(lán)色方框內(nèi)區(qū)域在不同時間點(diǎn)的超分辨圖像。(e), (f)圖d中藍(lán)色和白色方框內(nèi)區(qū)域在不同時間點(diǎn)的超分辨圖像

產(chǎn)品介紹

最后，我們介紹上述工作中所使用到的關(guān)鍵設(shè)備：

【IX3系列研究級倒置顯微鏡】

IX3系列(IX53/73/83)作為能提供活細(xì)胞成像的高度可擴(kuò)展的光學(xué)平臺，其建立在雄厚的技術(shù)基礎(chǔ)之上，擁有靈活的結(jié)構(gòu)，容易利用的光路，提供高分辨，高反差的寬場圖像。一切設(shè)計(jì)基于用戶的心聲，科學(xué)家的工作流程需要，廣泛應(yīng)用在細(xì)胞生物學(xué)，神經(jīng)生物學(xué)，發(fā)育生物學(xué)，分子生物學(xué)，光生物學(xué)等領(lǐng)域，將成為科研工作者進(jìn)行更高水平的活細(xì)胞研究的有力武器。

【X Line（翼系列）平場超復(fù)消色差物鏡】

X Line（翼系列）平場二代超復(fù)消色差物鏡(PlanXApo)，在平場超復(fù)消色差（PlanSApo）物鏡的技術(shù)基礎(chǔ)上突破創(chuàng)新，在平場性、色差矯正和分辨率三項(xiàng)技術(shù)的層面兼收并舉，同時囊括三項(xiàng)技術(shù)的尖端參數(shù)要求，滿足高質(zhì)量、大視場、高分辨率精確成像的要求，可以說，一枚物鏡就可以讓我們看得更多、更細(xì)、更美，也更自由。

Reference

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