P4SPR分子互作平臺在開發(fā)抗天冬酰胺酶抗體檢測方法中的應(yīng)用

接受天冬酰胺酶治療的急性淋巴細(xì)胞白血病患者的反應(yīng)監(jiān)測：等離子體傳感檢測在臨床樣品分析中的成功與挑戰(zhàn)

急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)是一種源于骨髓的未成熟白細(xì)胞發(fā)生癌變的疾病，除了阻止其他血細(xì)胞的正常功能外，還會在血流中引起增殖并隨后擴散到器官。大腸桿菌L -天冬酰胺酶(EcAII)作為一種生物治療劑，被證明對ALL有效的主要治療藥物之一。接受這種治療的挑戰(zhàn)，患者可能會通過產(chǎn)生抗體來中和EcAII，導(dǎo)致生化治療劑沉默失活，從而降低治療效果。
 

圖1  SPR檢測流程開發(fā)示意圖

目前在用L-天冬酰胺酶治療的白血病患者中量化抗天冬酰胺酶抗體的方法是酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）。能否開發(fā)一種新的檢測方法，樣本消耗更少、樣本制備更簡單、時效性也更好的方法，以整合到白血病治療與用藥監(jiān)測中呢？研究者在本文中，利用Affinite Instruments公司的P4SPR分子互作平臺開發(fā)了一種抗天冬酰胺酶抗體檢測方法。

研究中涵蓋了生物芯片的設(shè)計、配體的選型、檢測靈敏度與線性范圍的模型測試，以及實際臨床血液樣本的無稀釋檢測，與ELISA方法的對比與優(yōu)化等。

圖2 (A)抗天冬酰胺酶生物芯片 (B)不同的L -天冬酰胺酶受體結(jié)構(gòu) (C) L -天冬酰胺酶抗體直接檢測與間接檢測示意

如圖2所示，為了降低血清樣本與芯片的非特異結(jié)合，作者開發(fā)了一種表面多肽修飾的傳感芯片；同時為了考察配體固定時隨機固定與定向固定的區(qū)別，除了天然的EcAII，作者還表達(dá)了3種His-tag標(biāo)簽的EcAII：N21-EcAII，N末端20個氨基酸；N26-EcAII，N末端25個氨基酸；C8-EcAII，C末端8個氨基酸。

通過對比實驗，相比于其他3種樣本，研究者發(fā)現(xiàn)固定N26-EcAII有顯著的檢測重復(fù)性。

圖3 N26-EcAII受體檢測未稀釋人血清中兔抗天冬酰胺酶抗體SPR校正曲線(A)與SPR傳感圖

研究者選用N26-EcAII作為固定配體，通過在人血清中加入兔抗天冬酰胺酶抗體作為測試模型，結(jié)合校準(zhǔn)曲線，確定檢測限為0.5nM; 如圖3所示，當(dāng)分析物濃度在100nM-1uM之間時，有良好的檢測動態(tài)范圍。

檢測方法確立后，研究者作了臨床血液樣本的分析測試。

圖4 直接法SPR與ELISA分析結(jié)果比較

可能是樣品本身的異質(zhì)性(不透明度、色素等)及檢測方法亟待完善，如圖4所示，初始直接法獲得的SPR結(jié)果與ELISA結(jié)果也有顯著差異；8個樣本中，只有3個樣本的SPR結(jié)果與ELISA檢測有相關(guān)性。

為了克服樣本異質(zhì)性的影響，同時不影響分析靈敏度和樣品制備環(huán)節(jié)，在此基礎(chǔ)上，使用與ELISA分析相同的二抗，研究者開發(fā)了二次檢測步驟。

圖5 間接法SPR與ELISA分析結(jié)果比較

在改良后的SPR實驗中，如圖5所示，8個樣本中，7個樣本檢測結(jié)果SPR法與ELISA法一致。研究者推測，樣本7檢測結(jié)果不一致，可能與L-天冬酰胺酶固定時的立體結(jié)構(gòu)方向有關(guān)，與該患者免疫表達(dá)抗體的結(jié)合位點沒有有效暴露而導(dǎo)致。

在本文中，研究者通過多角度的摸索優(yōu)化，在SPR平臺上，首次實現(xiàn)了對臨床血樣中天冬酰胺酶抗體的無稀釋檢測。雖然在針對臨床樣本檢測中還存在樣本異質(zhì)性、檢測靈敏度等挑戰(zhàn)，但同時該文為疾病的預(yù)后監(jiān)測研究提供了一種新思路。
 

在該文獻(xiàn)中，研究者使用的是Affinite Instruments公司的個人型分子互作儀P4SPR。P4SPR分子互作儀，四通道設(shè)計，獨特的3+1流路模式，一次試驗即可獲得三次重復(fù)實驗數(shù)據(jù)，參照通道可實時扣除背景信號；與傳統(tǒng)的互作分析方法比較，個人型分子互作儀P4SPR可提供快速、實時、無標(biāo)記的互作檢測分析；適合于蛋白、多肽、核酸、多糖、小分子等多種樣品分析；同時，P4SPR也是一款普通實驗室即可買得起用得起的分子互作檢測利器。