液滴微流控技術(shù)與酶定向進(jìn)化：高通量篩選策略驅(qū)動的革新

進(jìn)化對于生命的產(chǎn)生和復(fù)雜性的生成是至關(guān)重要的，會引起生物各個層次的多樣性：從生物圈層、物種、生物個體甚至到分子層面。在分子生物學(xué)層面，酶是自然界中特有的催化劑，將反應(yīng)壁壘降低，從而特異性地使某些反應(yīng)加速。在自然界中，酶經(jīng)歷了自然選擇進(jìn)化，從而使生物體內(nèi)的反應(yīng)特異與高效。但由于酶的自然活性通常不足以滿足工業(yè)化應(yīng)用的需要，因此人工選擇和篩選變得越來越重要。整個產(chǎn)業(yè)也從天然酶的簡單發(fā)現(xiàn)過渡到對于酶特定功能的定向優(yōu)化。
 

過去，酶定向進(jìn)化及篩選天然新酶的通量極大程度受限于篩選工具與方法學(xué)。經(jīng)過二十年的發(fā)展，科學(xué)家們開發(fā)了基于液滴微流控的通用工具以滿足超高通量篩選的需求。從批量乳化到芯片上的液滴制備和分選，微流控技術(shù)提供了眾多用于高通量篩選的工具，定向進(jìn)化大大受益于這些技術(shù)進(jìn)步。下面，我們將按時間順序?yàn)榇蠹沂崂砻付ㄏ蜻M(jìn)化與基于微液滴微流控篩選的交織發(fā)展歷史。

 

 

1．開拓時代的諾獎獲得者：瓊脂板篩選與中低通量 MTP 測定

 

2018 年諾貝爾化學(xué)獎授予了美國科學(xué)家 Frances Arnold 和 George Smith 以及英國科學(xué)家格 Gregory Winter，以表彰他們在酶的定向演化以及用于多肽和抗體的噬菌體展示技術(shù)方面取得的成果。定向進(jìn)化使得通過基因手段改善生物活性成為可能，這種方法通常比自然選擇更快且更易控制。定向進(jìn)化研究除了對科學(xué)進(jìn)步具有重要意義以外，同時具有巨大的工業(yè)潛力應(yīng)用價值。它能以簡單快捷的方式替代漫長而昂貴的自然進(jìn)化過程。這種方法因此提供了一種環(huán)境友好的途徑，將酶作為替代傳統(tǒng)化學(xué)的方法加以利用。

 

 

 

 

在一項(xiàng)開創(chuàng)性的研究中，Arnold 及其同事通過微量滴定板（MTP）篩選突顯了使用 Subtilisin E 進(jìn)行定向進(jìn)化的潛力。通過篩選約 4000 個菌落，他們進(jìn)化出了一種能夠在 60％ 二甲基甲酰胺（DMF）中對肽底物的水解效率比野生型提高 256 倍的突變體。之后，許多聚焦微量滴定板（MTP）的體外和體內(nèi)研究被陸續(xù)報道。

 

另一種中通量的方法是使用瓊脂板篩選分析。其中一個典型的例子就是將轉(zhuǎn)氨酶作為手性胺合成的生物催化劑進(jìn)行定向進(jìn)化。這是將酶催化反應(yīng)封閉在細(xì)胞內(nèi)或?qū)�熒光產(chǎn)物固定在細(xì)胞表面以提高通量的另一種策略，已被應(yīng)用于多個系統(tǒng)，例如 P450 單加氧酶的進(jìn)化。

 

上述方法開創(chuàng)了酶篩選進(jìn)化的時代，而時代的快速發(fā)展，也讓這些方法迅速遇上了瓶頸。如果對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)-活性位點(diǎn)不太清楚，需要篩選大量突變體才能獲得目標(biāo)表型：通常通過對蛋白質(zhì)進(jìn)行更全面的突變實(shí)現(xiàn)，因此需要篩選的突變體數(shù)量呈指數(shù)增長。例如，以對 4 個位置同時隨機(jī)化為例，需要篩選 300 萬以上的突變體。使用基于微量滴定板的常規(guī)篩選方法可能需要超過 80 年（大約 20 個博士�。┑氖謩雍Y選，并需要大耗材，如篩選緩沖液（> 100 L）和昂貴的催化劑溶液（> 1 L）。相比之下，同樣的篩選工作使用液滴微流控或者熒光激活細(xì)胞分選（FACS）篩選方法，單個操作員大約一周內(nèi)即可完成，且所需耗材大大降低（圖 1）。

 

圖 1.

 

2．向高通量邁進(jìn)：光學(xué)讀數(shù)與 FACS 的興起

 

光學(xué)讀數(shù)的興起與 FACS 技術(shù)的應(yīng)用，在酶定向進(jìn)化邁向高通量的路上起到了關(guān)鍵性作用。在定向進(jìn)化中，將目標(biāo)酶的活性（即表型）與其遺傳信息（即基因型）聯(lián)系起來是一個關(guān)鍵點(diǎn)，這對于篩選、選擇和最終的進(jìn)化活動是至關(guān)重要的。為了實(shí)現(xiàn)大規(guī)模篩選，快速的表征方法如光學(xué)讀數(shù)方法（顏色、熒光或發(fā)光），是必不可少的。通常，工業(yè)上相關(guān)的目標(biāo)產(chǎn)物缺乏容易檢測的表型。在這種情況下，需要使用產(chǎn)生熒光、發(fā)光或比色讀數(shù)的底物類似物，這些讀數(shù)與酶活性相關(guān)聯(lián)。通過這些底物，我們就可以使用光學(xué)表征方法快速地對酶的活性進(jìn)行判讀。例如將酶反應(yīng)在細(xì)胞內(nèi)/外隔離或?qū)�熒光產(chǎn)物固定在細(xì)胞表面上使用 FACS 能夠快速并高通量地篩選。這些策略為FACS等高通量分析方法開辟了道路 。

 

雖然熒光產(chǎn)物留在細(xì)胞內(nèi)或固定在細(xì)胞上的方法與高通量 FACS 兼容，但存在潛在的交叉污染風(fēng)險，產(chǎn)生假陽性。并且FACS篩選方法與某些底物不相容，導(dǎo)致 FACS 在酶進(jìn)化方向的應(yīng)用受限，需要尋求新的方法解決這些問題。

 

 

3．超高通量新時代：微滴微流控技術(shù)的發(fā)展

 

工程學(xué)和生物化學(xué)研究者一起努力 20 多年，通過不斷改進(jìn)現(xiàn)有系統(tǒng)并開發(fā)出新的微滴微流控系統(tǒng)（圖 2），在酶定向進(jìn)化中實(shí)現(xiàn)了一些里程碑的應(yīng)用。液滴微流控技術(shù)制備的表面活性劑穩(wěn)定的單（油中水）或雙（油中水中）乳化液滴（分別為 SEs 和 DEs），因其對溫度、pH 等一系列物理化學(xué)因素的長期穩(wěn)定性，構(gòu)成了定向進(jìn)化的最佳體外間隔（IVC），能夠避免潛在的交叉污染， 并能兼容不同的底物，保持表型-基因型連鎖。微滴微流控技術(shù)的迅猛發(fā)展，讓大家意識到該技術(shù)能夠解決 FACS 的瓶頸問題，因此，酶進(jìn)化領(lǐng)域也迅速地對微滴微流控技術(shù)的應(yīng)用展開了深入且廣泛的研究。

 

IVC 在過去 20 年中受到廣泛關(guān)注，并與定向進(jìn)化研究的發(fā)展同步進(jìn)行。定向進(jìn)化研究直接受益于液滴微流體的發(fā)展，讓科學(xué)家們能夠更快速地篩選更大的文庫。反過來，對更細(xì)分和強(qiáng)大的定向進(jìn)化對工具的需求也推動了微滴微流控技術(shù)的研究進(jìn)展。

 

圖 2. 過去二十年，液滴微流控技術(shù)發(fā)展與酶定向進(jìn)化應(yīng)用的里程碑

 

 

油包水液滴，也稱為單乳液液滴，是被油相包圍的水室。通過使用表面活性劑（即在水/油界面上，兩性分子自動排列的分子）可以穩(wěn)定這些液滴。隨著研究的不斷深入和發(fā)展，科學(xué)家們也開發(fā)了增加復(fù)雜性的液滴生成方法，以更好地控制液滴的大小、吞吐量或試劑的封裝。

 

1．技術(shù)進(jìn)展 I：基于微流控的液滴形成

 

液滴微流控技術(shù)的發(fā)展，可以更好的控制高通量的單分散液滴的生成和包裹。與大體系不均勻乳化的方法相比，微流控方法需要制造設(shè)備并操作，但能夠高通量封裝分散液滴（圖 3A）。Thorsen 等人的第一項(xiàng)研究介紹了用一個T形交叉口裝置以 20-80 Hz 頻率能產(chǎn)生乳液的方法（圖 3B）。Anna 等人展示了在流動聚焦通道幾何形狀下控制了小至 10 μm 直徑的液滴形成（圖 3C）。后來使用了類似的通道幾何形狀來實(shí)現(xiàn)不同的功能：液滴內(nèi)試劑混合、液滴分裂，不同大小液滴的自發(fā)合并和試劑注入液滴。

 

圖 3. 基于微流控芯片的單分散水/油（w/o）乳液微滴形成

 

對于定向進(jìn)化而言，每個液滴理想情況下應(yīng)當(dāng)只包含一個細(xì)胞。然而，使用微流控裝置進(jìn)行細(xì)胞包裹遵循泊松分布，低細(xì)胞濃度時會導(dǎo)致大多數(shù)液滴為空液滴，從而降低有效通量。一些研究表明可以在微流控裝置上克服泊松分布的限制。使用特定的通道幾何形狀和在高流速下產(chǎn)生的流體動力學(xué)效應(yīng)來排序細(xì)胞，不同的細(xì)胞類型包裹率都高達(dá) 80% （圖 3D）。

 

另一個影響液滴微流控系統(tǒng)與定向進(jìn)化兼容性的關(guān)鍵方面在于液滴能將目標(biāo)酶反應(yīng)底物和產(chǎn)物限制在微液滴反應(yīng)體系中。Courtois 等人在他們的研究中探究了熒光素衍生物底物從液滴滲漏到油相中的情況，并通過添加牛血清白蛋白將保留時間提高到了 18 個小時以上。作者通過表征大腸桿菌細(xì)胞表達(dá)的堿性磷酸酶的酶活性及區(qū)分了空滴與含有細(xì)胞的滴液，證明了系統(tǒng)的多功能性。另外，使用前面描述的凝膠珠也可以解決 w/o 乳液中底物和產(chǎn)物的保留問題，這種凝膠珠同樣可以通過液滴微流控技術(shù)制備（圖 3E）。

 

2．技術(shù)進(jìn)展 II：芯片上液滴的觀察、操縱和分選

 

到目前為止，所描述的大多數(shù)技術(shù)發(fā)展都是基于對一步法的過程和反應(yīng)進(jìn)行的優(yōu)化。然而，許多反應(yīng)需要多個步驟，需要添加新的試劑或不同的反應(yīng)條件。隨著液滴微流控技術(shù)的發(fā)展，液滴生成、融合、控制和分析等更多選擇陸續(xù)出現(xiàn)（圖 4）。

 

圖 4. 技術(shù)進(jìn)展 II：在芯片上觀察、操縱和分選液滴

 

微流控技術(shù)的一個重要進(jìn)展是在微流控通道中集成產(chǎn)生電場的電極。Chabert 等人在早期研究中探討了使用液滴微流控添加試劑的方法。利用交流電場，他們在靜態(tài)和流動條件下成功地移動和合并了直徑為 600 微米的液滴。先驅(qū)性的研究又推動了高通量控制試劑注入液滴的開發(fā)。 

 

然而，電極的使用不局限于液滴融合，而且還能用于液滴的移動。Ahn、Kerbage 等人就報道了一種基于介電泳力將液滴引導(dǎo)至微流控通道交聯(lián)處的任意一側(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對于微液滴的分選。在對微液滴能夠?qū)崿F(xiàn)操作后，一些研究小組也開發(fā)了在芯片上對液滴中進(jìn)行熒光檢測技術(shù)。在早期的研究中，Dittrich 等人將體外表達(dá)反應(yīng)體系和紅移熒光蛋白的基因片段（rsGFP）包裹在液滴中注入微流控芯片，并使用熒光光譜在芯片上檢測微液滴中蛋白的熒光信號。結(jié)合靈敏的熒光檢測和介電泳分選技術(shù)，第一款熒光液滴分選（FADS）設(shè)備得以開發(fā)。

 

3．微液滴技術(shù)用于體外表達(dá)系統(tǒng)的酶進(jìn)化超高通量篩選

 

基于以上液滴操縱技術(shù)的發(fā)展，科學(xué)家們建立了體外表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)文庫以實(shí)現(xiàn)高通量篩選。例如，F(xiàn)allah-Araghi 等人建立了一個完全體外表達(dá)篩選平臺，用于從單個基因開始篩選編碼酶 β- 半乳糖苷酶的活性基因。在研究中，在液滴融合與分選之前，先將單基因片段與體外表達(dá)體系包裹在液滴中。在活性 lacZ 基因與非活性 lacZ mut 基因的比例為 1:100 的模型中，通過一輪篩選實(shí)現(xiàn)了對活性基因 502 倍的富集�；�于這些例子，Goto 等人報道了一種用于納升液滴封裝和分選的裝置，并將該方法用于從變異鏈球菌（Streptococcus Mutans）中篩選活性更高的異檸檬酸脫氫酶（IDH）。從一個 1000 個變異體的文庫開始，在兩輪篩選后，他們分離出一種比野生型異檸檬酸脫氫酶活性高約 3 倍的變異體。這些結(jié)果充分顯示了基于微液滴技術(shù)用于酶定向進(jìn)化的可行性。

 

圖 5. 微流控平臺的設(shè)計(jì)與操作

 

4．微液滴技術(shù)在細(xì)胞表達(dá)載體中實(shí)現(xiàn)基于生化反應(yīng)的酶進(jìn)化超高通量篩選

 

于此同時，使用細(xì)胞作為表達(dá)載體的方法也被開發(fā)與應(yīng)用于高通量篩選。在Abate、Baret、Griffiths 和 Weitz 等學(xué)者的研究中，他們使用芯片式液滴產(chǎn)生和介電泳分選技術(shù) 對表面展示了過氧化物酶（HRP）文庫的酵母細(xì)胞進(jìn)行了高通量篩選（圖 6）。研究中對多達(dá) 10⁷個變異體庫進(jìn)行了篩選，并在九輪篩選中實(shí)現(xiàn)了總體約 7 倍的催化效率提高。最高的催化效率達(dá)到了約 2.5×10⁷ M^-1 s^-1，接近擴(kuò)散限制效率（即 10⁸ M^-1 s^-1）。類似原理還成功的應(yīng)用于耐熱木聚糖酶的進(jìn)化（提高活性高達(dá) 4.7 倍）和酵母細(xì)胞作為生產(chǎn)宿主的改善（ a- 淀粉酶產(chǎn)量增加 2 倍）。 

 

2015 年 Abate 等人展示了首個基于微液滴技術(shù)用于大腸桿菌篩選的實(shí)例。通過將微流控技術(shù)與下一代測序（NGS）相結(jié)合，繪制了蛋白質(zhì)序列-功能關(guān)系，分析了分選和未分選的群體。從 6×10⁷個變異體庫開始，使用單輪突變，提高了糖苷酶在較高溫度的活性。這種深度突變掃描的方法，揭示了糖苷酶活性至關(guān)重要的基因區(qū)域。

 

圖 6. HRP gene 定向進(jìn)化實(shí)驗(yàn)的示意圖 

 

5．微液滴熒光分選技術(shù)用于實(shí)現(xiàn)催化活性的酶定向進(jìn)化高通量篩選

 

如果初始酶的催化活性較低，定向進(jìn)化與篩選就尤為重要�；�于微流控篩選的熒光激活液滴分選（FADS）技術(shù)，Hilvert 和其同事利用胺催化作用進(jìn)化了一種反-醛縮酶（圖 6）。使用液滴微流控技術(shù)，科學(xué)家將表達(dá)文庫大腸桿菌與熒光底物、細(xì)胞裂解液共同包裹在液滴中。對六個文庫進(jìn)行篩選，在單次篩選中鑒定出一種與底物親和力幾乎增加 80 倍的變異體酶。 在依靠中通量篩選（使用 MTP）方法時，這項(xiàng)研究需要進(jìn)行五輪定向進(jìn)化來安裝這些突變。利用微液滴高通量篩選技術(shù)，僅經(jīng)過兩輪進(jìn)化，就確定出表現(xiàn)最好的突變體，其包括 10 個突變體酶，k_cat/K_M 增加 73 倍和對 (S)- 甲醇的偏好增加了 10 倍 。同一小組還報告了從 10⁷ 個變異庫單輪篩選即鑒定出了一種活性環(huán)己胺氧化酶（CHAO），重塑了 CHAO 的活性位點(diǎn)，使催化效率提高了 960 倍，接近了非天然底物的野生型活性水平。

 

圖 7. 基于微流控?zé)晒饣顒雍Y選技術(shù)的反醛酶定向進(jìn)化

 

 

過去 20 年中，液滴微流控技術(shù)的進(jìn)步為發(fā)現(xiàn)具有新功能或改進(jìn)功能的酶邁出了決定性的一步。更高的通量和簡化的篩選顯著縮短了規(guī)模的庫定向進(jìn)化時間并降低了物質(zhì)消耗。

 

許多研究小組現(xiàn)在正在致力于改進(jìn)在工業(yè)或醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有重要意義的酶。除了進(jìn)化自然酶外，定向進(jìn)化的工具箱還擴(kuò)展到人工酶，以引入在制藥工業(yè)中急需的非自然反應(yīng)性，包括設(shè)計(jì)全新的酶以了解和重新設(shè)計(jì)酶的活性位點(diǎn)，最近更是結(jié)合機(jī)器學(xué)習(xí)進(jìn)行定向進(jìn)化。此外，由于一些熒光底物無法合成，因此快速但非基于熒光檢測的新策略對于未來的發(fā)展至關(guān)重要。

 

液滴微流控為自動化工作流和更快的篩選鋪平了道路。為了繼續(xù)在這個繁榮的領(lǐng)域前行，必須進(jìn)一步簡化微流控系統(tǒng)，以使非專業(yè)人員能夠?qū)ξ⒘骺卦O(shè)備進(jìn)行可靠的操作。目前，很多高校以及研究所實(shí)驗(yàn)室在酶進(jìn)化方向已經(jīng)有很多探索，但在工業(yè)屆的大規(guī)模應(yīng)用仍然受制于成熟儀器、成熟方法學(xué)的廣泛應(yīng)用。