數(shù)字恒溫 CRISPR 技術(shù)-液滴微流控與恒溫?cái)U(kuò)增的聯(lián)合應(yīng)用

CRISPR-Cas 系統(tǒng)自問世以來，從作為基因編輯的利器開始，發(fā)展至今已成為核酸檢測(cè)的新型工具。特別是近年來，新型冠狀病毒的快速檢測(cè)需求增大。國(guó)內(nèi)多位專家已發(fā)表過多篇應(yīng)用 CRISPR-Cas 技術(shù)快速、靈敏地檢測(cè)新冠病毒的文章。但目前基于 CRISPR 技術(shù)的檢測(cè)仍以定性檢測(cè)為主，定量檢測(cè)仍有方法學(xué)上的難度。因此，在保證能定量研究的前提下確保檢測(cè)方法的靈敏度、特異性和時(shí)效性是如今研究的下一個(gè)重點(diǎn)。

達(dá)普生物的聯(lián)合創(chuàng)始人姚舒懷教授團(tuán)隊(duì)利用液滴微流控技術(shù)，在 CRISPR診斷領(lǐng)域合作取得新的進(jìn)展。姚教授團(tuán)隊(duì)將 RPA 擴(kuò)增與 Cas13a 檢測(cè)融合為一步法 MEDICA（Microfluidics-Enabled Digital Isothermal Cas13a Assay），此方法不僅減少了 CRISPR 技術(shù)的檢測(cè)時(shí)間，而且保證了檢測(cè)方法的靈敏度、特異性，更是實(shí)現(xiàn)了對(duì)檢測(cè)目標(biāo)的絕對(duì)定量。該成果發(fā)表于分析化學(xué)領(lǐng)域的頂級(jí)期刊 Analytical Chemistry，影響因子 8.008。

香港科技大學(xué)姚舒懷團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，大多數(shù) CRISPR 檢測(cè)診斷平臺(tái)通過檢測(cè)熒光或條帶，得到一個(gè)可視化、定性的結(jié)果。當(dāng)需要相對(duì)定量的時(shí)候，需要 RPA 擴(kuò)增及 Cas13a 檢測(cè)兩個(gè)步驟，并且使用熒光定量 PCR 通過一定的擴(kuò)增循環(huán)與熒光檢測(cè)來實(shí)現(xiàn)。這給工作流程帶來更多的不確定性，且定量還會(huì)受到標(biāo)準(zhǔn)曲線的限制與影響。在本文中，姚教授將 RPA 反應(yīng)與 Cas13a 檢測(cè)通過微流控技術(shù)結(jié)合到一步法中（MEDICA），不僅提升了檢測(cè)靈敏度，而且實(shí)現(xiàn)了穩(wěn)定的絕對(duì)定量。
 

使用達(dá)普液滴微流控技術(shù)，將水相 1（檢測(cè)模板、預(yù)混液）與水相 2（MgOAc）在需要反應(yīng)時(shí)進(jìn)行混合，混合后的水相與油相在微流控芯片中生成微液滴，再進(jìn)行恒溫反應(yīng)。初始模板在分配進(jìn)微液滴時(shí)符合泊松分布，因此可以根據(jù)泊松分布模型進(jìn)行絕對(duì)定量的計(jì)算工作。
 

本文在試驗(yàn)優(yōu)化及驗(yàn)證階段，姚教授團(tuán)隊(duì)通過不同濃度及 pH 的 Tris-HCL、不同濃度的鹽條件（NH₄(SO₄)₂, NaCl, KCl, CH₃COOK）及不同濃度的 PEG、Tween-20、引物探針等進(jìn)行摸索試驗(yàn)，最終選定了一個(gè)最佳的優(yōu)化條件。

在確定了反應(yīng)最佳條件后，姚教授團(tuán)隊(duì)使用 HPV 16 質(zhì)粒構(gòu)建并且驗(yàn)證了一步法 RPA + Cas13a 于微流控體系中（數(shù)字恒溫 CRISPR 方法）。上圖可見，構(gòu)建的數(shù)字恒溫 CRISPR 方法靈敏度達(dá)到 1~5 copies/μL，穩(wěn)定性也表現(xiàn)出色。

為了檢驗(yàn)方法學(xué)在實(shí)際臨床應(yīng)用中的性能，姚教授團(tuán)隊(duì)使用質(zhì)粒進(jìn)行線性關(guān)系驗(yàn)證與臨床樣本進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果均展現(xiàn)較好的一致性。

姚教授團(tuán)隊(duì)構(gòu)建的數(shù)字恒溫 CRISPR 方法與臨床使用 qPCR 方法檢測(cè) HPV16/HPV18 結(jié)果對(duì)比，陰陽性符合率達(dá)到 100%，并且將 CT 值與數(shù)字恒溫 CRISPR 方法得到的絕對(duì)定量結(jié)果做相關(guān)性分析，R²＞0.95/0.93（HPV16/HPV18）。方法學(xué)產(chǎn)生差異的原因可能是 qPCR 標(biāo)準(zhǔn)品是由質(zhì)粒代替，在低濃度下（CT 值 36 左右）與臨床樣本具有一定的差異性。另外，qPCR 會(huì)因?yàn)榛�因的偏好性，而展現(xiàn)出不同的擴(kuò)增效率。由此可見，數(shù)字恒溫 CRISPR 方法無需依賴標(biāo)準(zhǔn)品即可進(jìn)行絕對(duì)定量，并且可以帶來更快的檢測(cè)速度和更靈敏的檢測(cè)下限。

達(dá)普生物秉承為廣大科研及臨床工作者和企業(yè)客戶提供世界領(lǐng)先技術(shù)平臺(tái)的理念，聚團(tuán)隊(duì)研發(fā)力量結(jié)晶開發(fā)了基于微流控技術(shù)的全流程解決方案。