研究神經(jīng)系統(tǒng)狀況和疾病的5種多功能體外試驗(yàn)詳解
神經(jīng)系統(tǒng)疾病是全世界重大的健康負(fù)擔(dān)，近六分之一的人患有神經(jīng)系統(tǒng)狀況和疾病。
這些疾病會(huì)影響整個(gè)神經(jīng)系統(tǒng)，包括大腦、脊髓和周圍神經(jīng)系統(tǒng) (PNS)，通常會(huì)導(dǎo)致殘疾或死亡。神經(jīng)系統(tǒng)疾病可能由許多不同的因素引起，例如環(huán)境/營養(yǎng)影響、基因突變或外傷。示例是神經(jīng)退行性疾病，如不同形式的癡呆（例如，阿爾茨海默氏癥）、帕金森氏病和肌萎縮側(cè)索硬化癥 (ALS)，還有中風(fēng)、腦癌、傳染�。ɡ�，腦膜炎）和損傷。
神經(jīng)科學(xué)研究的重點(diǎn)是研究中樞神經(jīng)系統(tǒng) (CNS) 和周圍神經(jīng)系統(tǒng) (PNS) 的功能和組織，以了解神經(jīng)過程并開發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)疾病和病癥的生物標(biāo)志物和療法。
基于細(xì)胞的模型和檢測在分子和細(xì)胞神經(jīng)生物學(xué)中起著重要作用，因?yàn)樗鼈冊(cè)试S研究受控條件下的神經(jīng)細(xì)胞類型及其對(duì)各種刺激的反應(yīng)。體外試驗(yàn)也可用于研究與疾病相關(guān)的神經(jīng)功能變化的影響，以測試潛在的治療方法。
在 ibidi 細(xì)胞培養(yǎng)室上生長的小鼠海馬神經(jīng)元的共聚焦圖像。對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行 bIII-微管蛋白（綠色）、肌動(dòng)蛋白纖維（紅色）和細(xì)胞核（藍(lán)色）的免疫染色。圖片提供：意大利比薩高等師范學(xué)院 CNR 和 NEST 納米科學(xué)研究所的 Ilaria Tonazzini
在這篇文章中，我們介紹了 5 種基于細(xì)胞的體外試驗(yàn)方法來研究神經(jīng)系統(tǒng)狀況和疾病，并為每種檢測方法提供了應(yīng)用示例。
1. 熒光顯微鏡檢測
免疫熒光和熒光原位雜交 (FISH) 等熒光顯微鏡檢測用于使用熒光標(biāo)簽或探針可視化細(xì)胞或組織內(nèi)的特定分子或結(jié)構(gòu)。
在細(xì)胞和分子神經(jīng)生物學(xué)中，免疫熒光檢測（例如，免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫組織化學(xué)和原位雜交）可用于獲得對(duì)大腦和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)空間組織的重要見解。此外，標(biāo)記蛋白質(zhì)、DNA 和 RNA 可以可視化它們?cè)谶@些網(wǎng)絡(luò)中的功能角色，并可以揭示過程是否中斷。免疫熒光是一種多功能、直接的方法，可以可視化細(xì)胞結(jié)構(gòu)和成分的位置和相互作用。幾乎每個(gè)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室都可以輕松建立說明和工作流程。
多重?zé)晒猓ㄍ瑫r(shí)對(duì)多種蛋白質(zhì)進(jìn)行染色）甚至可以同時(shí)顯示不同的分子，這對(duì)于破譯蛋白質(zhì)的相互作用非常有用，例如，在神經(jīng)信號(hào)過程中。
應(yīng)用示例 1：免疫組織化學(xué)和熒光原位雜交 (FISH) 鑒定導(dǎo)致家族性 ALS 的突變
ALS 是一種慢性致命性神經(jīng)退行性疾病，會(huì)導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元逐漸喪失。ALS 導(dǎo)致肌肉退化和虛弱加劇，最終導(dǎo)致喪失移動(dòng)、說話、進(jìn)食和呼吸的能力。
大多數(shù) ALS 病例沒有已知原因（散發(fā)性 ALS），而 5% 到 10% 的病例是遺傳性的，可能與特定基因有關(guān)。在家族性 ALS 患者中發(fā)現(xiàn)了 FUS 基因的幾種突變。
Gadgil et al.使用熒光原位雜交 (FISH) 和免疫熒光來鑒定 ALS 相關(guān)的 FUS 突變 (FUS P525L)，該突變會(huì)破壞 U7 小核糖核蛋白 (U7 snRNP) 的定位。此外，他們還可以證明該突變體與 U7 snRNA 錯(cuò)誤共定位到細(xì)胞質(zhì)中并影響復(fù)制依賴性組蛋白基因（Gadgil 等人，2021 年）。
圖 1 SHSY5Y FUS 敲除細(xì)胞轉(zhuǎn)染含有 FUS 基因的質(zhì)粒，F(xiàn)US 基因帶有 ALS 相關(guān)的 FUS P525L 突變。轉(zhuǎn)染后 48 小時(shí)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行 U7 snRNA 和 FUS 共染色。綠色：U7 snRNA 的 FISH 染色。紅色：FUS P525L。藍(lán)色：藍(lán)色的細(xì)胞核 (DAPI)。在ibidi蓋玻片底部培養(yǎng)室對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色和成像。由波蘭波茲南 Uniwersytetu Poznańskiego 先進(jìn)技術(shù)中心 RNA 加工實(shí)驗(yàn)室的 Ankur Gadgil 友情提供。
2.活細(xì)胞成像
活細(xì)胞成像是一種強(qiáng)大的工具，可以實(shí)時(shí)可視化生理?xiàng)l件下的細(xì)胞過程。
阿爾茨海默氏癥或多發(fā)性硬化癥 (MS) 等神經(jīng)退行性疾病的特征是大腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)內(nèi)的動(dòng)態(tài)細(xì)胞過程發(fā)生變化。這些改變的過程會(huì)導(dǎo)致大腦中蛋白質(zhì)運(yùn)輸和分類功能失調(diào)以及蛋白質(zhì)聚集。神經(jīng)遷移、趨化性和血管生成也是在神經(jīng)健康和疾病中發(fā)揮重要作用的動(dòng)態(tài)過程的示例（應(yīng)用示例 2–5）。
活細(xì)胞成像允許在生理?xiàng)l件下實(shí)時(shí)跟蹤這些動(dòng)態(tài)過程 ( Mov. 1 )。
3. 遷移和趨化性測定
細(xì)胞遷移和趨化性是神經(jīng)系統(tǒng)的基本過程，在各種神經(jīng)疾病的病理生理學(xué)中起著重要作用。例如，它們參與神經(jīng)發(fā)育、受傷后的神經(jīng)炎癥以及腦癌的進(jìn)展過程。
通過在活細(xì)胞成像期間跟蹤單個(gè)細(xì)胞（應(yīng)用示例 2）或通過將無細(xì)胞間隙引入細(xì)胞群并觀察細(xì)胞覆蓋區(qū)域的變化，可以在單細(xì)胞水平上研究細(xì)胞遷移動(dòng)力學(xué)隨著時(shí)間的推移，間隙閉合（應(yīng)用示例 3，工作流程圖 2）。
趨化性是細(xì)胞響應(yīng)化學(xué)信號(hào)的定向運(yùn)動(dòng)。體外趨化性測定允許對(duì)細(xì)胞向特定分子的遷移進(jìn)行定性和定量分析（應(yīng)用示例 4，工作流程圖 3）。
應(yīng)用實(shí)例2：遷移原代雪旺細(xì)胞的活細(xì)胞成像
雪旺細(xì)胞是 PNS 的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。它們支持和保護(hù)神經(jīng)元，在傳遞神經(jīng)沖動(dòng)以及神經(jīng)發(fā)育和再生方面發(fā)揮著重要作用。因此，他們對(duì)再生醫(yī)學(xué)非常感興趣，以開發(fā)在神經(jīng)損傷情況下增強(qiáng)雪旺細(xì)胞遷移潛能的療法。Millesi et al.使用活細(xì)胞成像 (Mov. 1) 研究了初級(jí)雪旺細(xì)胞遷移。他們還探索了膠原蛋白纖維的再生作用，作為長距離周圍神經(jīng)缺陷的治療選擇（Millesi et al，2021 年）。
圖 1，雪旺細(xì)胞的活細(xì)胞成像，軌跡線跟隨其遷移模式。細(xì)胞在µ-Slide 4 Well上培養(yǎng)，并使用 ibidi Stage Top 孵育系統(tǒng)成像。使用 Image J Manual Tracking plugin和Chemotaxis and Migration Tool進(jìn)行細(xì)胞追蹤和分析。友情提供：奧地利維也納醫(yī)科大學(xué)整形、重建和美容外科系的 F. Millesi。
應(yīng)用實(shí)例 3：生長分化因子 11 (GDF11) 處理對(duì)軸突再生和細(xì)胞遷移的影響
創(chuàng)傷性脊髓損傷 (SCI) 可能是事故或疾病的結(jié)果。造成的傷害是不可逆轉(zhuǎn)的，通常會(huì)導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)功能喪失和癱瘓。
治療干預(yù)的重點(diǎn)是抑制脊髓急性損傷后的神經(jīng)退行性過程。Tsai et al.研究了 GDF11 是否影響脊髓損傷后的神經(jīng)生成。他們?cè)诖嬖诤筒淮嬖?GDF11 的情況下對(duì)脊髓神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行了傷口愈合實(shí)驗(yàn)（工作流程見圖 2）。2 天后，他們觀察到在 GDF11 存在的情況下細(xì)胞遷移和神經(jīng)突延伸顯著增強(qiáng)（Tsai et al，2022 年）。
圖 2 使用Culture-Insert 2 Well進(jìn)行傷口愈合實(shí)驗(yàn)的工作流程。
應(yīng)用實(shí)例 4：神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)趨化因子 CC 配體 5 的趨化性測定
膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是一種生長迅速、侵襲性強(qiáng)的惡性腦腫瘤，預(yù)后較差（中位生存期為 1.5 年）。有多種治療方法（手術(shù)、放療、化療），但由于殘留的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞具有耐藥性，腫瘤復(fù)發(fā)很常見。腫瘤微環(huán)境在其發(fā)展和進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用。膠質(zhì)瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞 (GAM) 是浸潤在腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞，與促進(jìn)腫瘤生長、血管生成和侵襲有關(guān)。GAM 已被證明是 CC 基序趨化因子配體 5 (CCL5) 的來源，CCL5 是一種豐富的趨化因子，在細(xì)胞免疫反應(yīng)中發(fā)揮促炎作用。它在 GAM 中的表達(dá)通過觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)傳導(dǎo)和誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶 (MMP) 進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。
Yu-Ju Wu et al.建立 3D 趨化性測定（工作流程圖 3）以研究存在和不存在粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子 (GM-CSF) 的情況下膠質(zhì)瘤細(xì)胞的趨化性侵襲，GM-CSF 存在于體內(nèi)膠質(zhì)瘤微環(huán)境中( Yu -Ju Wu et al.，2020）。
圖 3 使用µ-Slide 細(xì)胞趨化載玻片進(jìn)行趨化性實(shí)驗(yàn)的工作流程。
4. 管形成分析
血管發(fā)育（血管生成）是神經(jīng)健康和疾病的關(guān)鍵過程。血管生成需要一系列由缺氧引發(fā)的細(xì)胞事件。
管形成試驗(yàn)（工作流程圖 4）是一種廣泛建立的體外方法，用于研究血管生成和尋找促進(jìn)或抑制血管生成的化合物。在神經(jīng)退行性研究中，管形成分析可用于開發(fā)促進(jìn)急性腦損傷后血管再生的療法（應(yīng)用示例 5），或表征抑制為腦腫瘤提供營養(yǎng)的血管形成的分子。
應(yīng)用實(shí)例 5：Tube Formation Assay 研究腦外傷后血管再生
創(chuàng)傷性腦損傷 (TBI) 可以通過多種方式影響腦血管，導(dǎo)致血腦屏障 (BBB) 破壞、顱內(nèi)壓升高、腦血管痙攣和出血。這些影響會(huì)導(dǎo)致 TBI 后腦損傷和神經(jīng)功能缺損的嚴(yán)重程度。FGF20是成纖維細(xì)胞生長因子家族的一員，已被證明具有神經(jīng)保護(hù)作用，因此與帕金森病的治療有關(guān)。
Guo et al.有興趣了解FGF20是否對(duì) TBI 后的腦血管系統(tǒng)也有保護(hù)作用。因此，他們使用管形成試驗(yàn)（工作流程圖 4）來研究 FGF20 是否可以在體外促進(jìn)永生化人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞 (hCMEC/D3) 中的血管生成（Guo et al，2021 年）。
圖 4 使用µ-Slide 15 Well 3D進(jìn)行血管生成實(shí)驗(yàn)的工作流程
5. 流動(dòng)條件下的細(xì)胞培養(yǎng)
流動(dòng)條件下的細(xì)胞培養(yǎng)是一種體外方法，用于模擬血管/淋巴管的生理?xiàng)l件，并研究流體流動(dòng)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的機(jī)械力（剪切應(yīng)力）的影響。該技術(shù)已被用于包括神經(jīng)科學(xué)在內(nèi)的各個(gè)研究領(lǐng)域，以研究神經(jīng)血管功能和神經(jīng)病理學(xué)。
流動(dòng)下的細(xì)胞培養(yǎng)使研究人員能夠在受控環(huán)境中研究機(jī)械力對(duì)內(nèi)皮腦血管細(xì)胞和 BBB 的影響。通過使內(nèi)皮細(xì)胞 (EC) 經(jīng)受流體流動(dòng)，研究人員可以模擬 BBB 的生理?xiàng)l件，并深入了解其功能和功能障礙的潛在機(jī)制（應(yīng)用示例 6）。
應(yīng)用實(shí)例6：hCMEC/D3細(xì)胞流體環(huán)境下培養(yǎng)
與所有 EC 一樣，人腦微血管 EC 會(huì)受到血流產(chǎn)生的恒定機(jī)械力（剪切應(yīng)力）的影響。與外周 EC 相比，剪切應(yīng)力對(duì) hCMEC 的細(xì)胞和分子效應(yīng)知之甚少。
在最近的一項(xiàng)研究中，Choublier 等人。在生理層流下培養(yǎng) hCMEC/D3 細(xì)胞以研究體外剪切應(yīng)力的影響（工作流程圖 5）。
他們使用 hCMEC/D3 細(xì)胞作為體外模型來研究 BBB，因?yàn)樗@示了 BBB 的許多關(guān)鍵特性，包括緊密連接、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和酶。他們可以表明，與沿流動(dòng)方向排列的外周內(nèi)皮細(xì)胞相比，hCMEC/D3 細(xì)胞垂直于流動(dòng)方向排列。隨后的蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明，層流生理剪切應(yīng)力會(huì)誘導(dǎo) hCMEC/D3 細(xì)胞靜止，從而導(dǎo)致 EC 以及 BBB 的保護(hù)和抗炎作用（Choublier 等人，2022）。
圖 5 使用 ibidi通道載玻片和ibidi 泵系統(tǒng)進(jìn)行流體環(huán)境下的細(xì)胞培養(yǎng)工作流程。
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