細(xì)胞活力檢測方法大盤點(diǎn)及CTG 發(fā)光法的應(yīng)用案例

 

常用的細(xì)胞活力檢測試劑主要有 MTT、CCK8 等檢測方法 (圖 1)。

MTT法：又稱 MTT 比色法。其檢測原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性 MTT 還原為不溶于水的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜 (Formazan) 并沉積在細(xì)胞中，但死細(xì)胞無此功能，后經(jīng) DMSO 溶解，于 490 nm 處測定吸光值便可間接反應(yīng)細(xì)胞活力。但該方法除去操作步驟耗時以外，生成的 Formazan 是不溶于水的，需經(jīng) DMSO 溶解后才能檢測，增加了工作量的同時仍不能保證測定結(jié)果的準(zhǔn)確性，且該溶劑對人體具有明顯毒性。

CCK8法：相較于 MTT，無論是操作步驟還是檢測時間都優(yōu)化了很多。CCK8 是一種基于 WST-8 而廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的快速、高靈敏度、無放射性的比色檢測方法(可看往期推文 CCK-8，讓細(xì)胞活性檢測 So Easy!)。但在實驗時，一直有個問題讓人很困擾——“細(xì)胞增殖越多越快，則顏色越深；細(xì)胞毒性越大，則顏色越淺”，但這個顏色深淺的標(biāo)準(zhǔn)我 “標(biāo)” 不出來怎么辦？痛點(diǎn)！痛點(diǎn)！痛點(diǎn)！

 
 

 科研汪 ：MTT 作為“元老”級別的檢測方法，雖然“老練”，Paper 無數(shù)，但麻煩是真麻煩，CCK8 法倒是便捷很多！

 小 M：那你是還沒用過更便捷的...

 科研汪 ：莫非你說的是細(xì)胞活力檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”？

 小 M：CTG 細(xì)胞活力檢測，簡單、靈敏、快速的均質(zhì)檢測方法，反應(yīng) 10 分鐘即可得到“Bling Bling”的檢測結(jié)果，你就說“快不快”？

 

CTG 發(fā)光法：基于高靈敏度生物發(fā)光檢測技術(shù)，通過對三磷酸腺苷 (ATP) 進(jìn)行定量以測定培養(yǎng)物中活細(xì)胞數(shù)目及細(xì)胞活力。該實驗方法可用三個字簡單概括 “快、準(zhǔn)、狠”，比 MTT 的處理速度快近 20 倍，節(jié)省時間近 4 小時。CTG 特有的均質(zhì)檢測法即 “加樣-混樣-檢測”，使用時，只需將本試劑等體積添加至培養(yǎng)細(xì)胞中即可進(jìn)行檢測。不用感慨，細(xì)胞活力檢測為什么不能如此簡單？

 

 

圖 1. MTT、CCK8 與 CTG 法的實驗流程圖

 
表 1. MTT、CCK8 與 CTG 法特點(diǎn)比較
 

 
首先，來了解實驗 CTG 發(fā)光法的測定原理：ATP 作為細(xì)胞新陳代謝的一個重要指標(biāo)，與活細(xì)胞數(shù)目呈良好的線性關(guān)系，是細(xì)胞活力檢測的重要標(biāo)志性分子。
ATP 生物發(fā)光的原理為：熒光素酶以熒光素、ATP 和 O₂ 為底物，在 Mg²⁺ 存在時，可將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為光能；在熒光素酶催化的發(fā)光反應(yīng)中，ATP 在一定的濃度范圍內(nèi)，其濃度與發(fā)光強(qiáng)度呈線性關(guān)系，即在光信號與酶反應(yīng)體系中，發(fā)光值與 ATP 呈正比，ATP 與活細(xì)胞數(shù)成正比，CTG 發(fā)光法通過 ATP 含量來進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)或活力測定，且不受化合物自發(fā)熒光的影響 (圖 2)，是細(xì)胞增殖測定，細(xì)胞活力測定和細(xì)胞毒性高通量篩選分析的理想選擇。

圖 2. CTG 法檢測原理 

■ 案例 1：細(xì)胞增殖測定

如圖 3 所示，為了探究 SIPL1 對 TNBC 細(xì)胞增殖的影響，將 SIPL1 表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至 BT-549 與 MDA-MB-231 細(xì)胞， 并使用 CCK8 法與 CTG 法，進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測。
 

CCK-8 檢測：TNBC 細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染 shRNA 或過表達(dá)質(zhì)粒并培養(yǎng) 24 h 后檢測。

CTG 發(fā)光細(xì)胞活力測定：TNBC 細(xì)胞在 37°C 下培養(yǎng)過夜。然后，將 100 µL CTG 溶液直接與培養(yǎng)基混合，在室溫下培養(yǎng) 20 分鐘。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染靶向 SIPL1 shRNAs 的 BT-549 和 MDA-MB-231 細(xì)胞系的細(xì)胞增殖顯著降低 (圖 3)。

圖 3. SIPL1 對 TNBC 細(xì)胞活力的影響^[1]

CCK-8 (a) 和 CTG 發(fā)光細(xì)胞活力測定 (b) 用指示載體轉(zhuǎn)導(dǎo) BT-549 和

MDA-MB-231 細(xì)胞增殖能力的分析。

 

■ 案例 2：細(xì)胞活力測定

如圖 4 所示，為了探究外源 RRM2 是否會影響肝癌細(xì)胞的鐵死亡，在 HepG2 和 SMMC-7721 細(xì)胞中過表達(dá)或敲除 RRM2，通過 CTG 法檢測其對細(xì)胞活力的影響。結(jié)果表明，過表達(dá) RRM2 時，細(xì)胞活力明顯增強(qiáng)，反之，敲除 RRM2 時，細(xì)胞活力明顯降低^[1]。

 

 

圖 4. 通過 CTG 法測定 RRM2 對細(xì)胞活力的影響^[2]

(a) 在體外表達(dá)或敲除 RRM2 的 HepG2 和 SMMC-7721 細(xì)胞中測量細(xì)胞死亡 (b) 和 4-HNE 水平 (c)，然后再用 Fer-1、ZVAD-FMK、Nec-1 或體外表達(dá)的 RRM2 進(jìn)行進(jìn)一步處理。細(xì)胞活力測定采用 CTG 發(fā)光細(xì)胞活力測定法。

 

■ 案例 3：細(xì)胞毒性高通量篩選分析

如下圖所示，作者團(tuán)隊報告了一種基于濃度-反應(yīng)曲線的表型定量高通量篩選 (qHTS)，旨在識別對瘧原蟲肝臟和無性血期寄生蟲具有活性的化合物 (圖 5)。使用 SYBR Green 或熒光素酶來測試對寄生蟲生長的抑制，共檢測了 456,817 種化合物。

在 qHTS 之后，又分類選擇了 4,253 種合成易處理的化合物，用于驗證抗瘧原蟲活性和哺乳動物毒性。在 3 μM 和 1 μM 濃度下對化合物進(jìn)行體外抗伯氏瘧原蟲肝期寄生蟲的評估。其中使用 CTG 法評估了所有 4,253 種化合物對 HepG2 的細(xì)胞毒性。其中 255 種化合物對 HepG2 細(xì)胞表現(xiàn)出一定程度的生長細(xì)胞毒性，AC₅₀ 值 < 43 µM (隨后被排除)。最終篩選出 994 種經(jīng)過驗證的無毒性化合物，用于針對肝階段寄生蟲的后續(xù)評估。

圖 5. 針對惡性瘧原蟲無性血期寄生蟲的定量高通量篩選^[3]。

   



   

對比測試結(jié)果表明：持續(xù) 3 h 的生物發(fā)光穩(wěn)定性的檢測中，MCE CTG Cell Viability Detection Reagent 的發(fā)光信號值比較穩(wěn)定 (圖 5a)；不同細(xì)胞數(shù)的線性范圍中，MCE 產(chǎn)品線性關(guān)系良好，與進(jìn)口 競品線性幾乎一致 (圖 5b)；且對于不同細(xì)胞系，MCE 產(chǎn)品與進(jìn)口競品檢測信號值相當(dāng) (圖 5c)。綜上檢測結(jié)果表明，MCE CTG 試劑盒可實現(xiàn)穩(wěn)定、靈敏、批次間差異較小的不同細(xì)胞系的細(xì)胞活力檢測。

表 2. MCE CTG Cell Viability Detection Reagent 產(chǎn)品特性

靠譜的細(xì)胞活力 CTG 檢測試劑，尊貴的 VIP 客戶體驗，想發(fā) SCI 深夢囈語的心。無需按捺您的“蠢蠢欲動”，小 M 早已備好你想要的試用裝 (試用裝鏈接)。體驗不收費(fèi)，時間最寶貴~ 快快申領(lǐng)吧！

實驗小 Tips，附上 CTG 使用注意事項，希望你能早日發(fā) SCI 啦。

1. 熒光素酶的活性對溫度較為敏感，反復(fù)凍融會致其逐漸失活，建議分裝凍存，避免反復(fù)凍融。凍融時，可能會導(dǎo)致試劑中出現(xiàn)少量沉淀，可平衡至室溫后觀測沉淀溶解情況，如仍有殘留，可離心后去除。
2. 本產(chǎn)品在使用或分裝時所使用耗材應(yīng)注意避免 ATP 污染。
3. 若待測藥物的溶劑含量較高，熒光素酶反應(yīng)可能會被干擾，致化學(xué)發(fā)光信號受到影響，可設(shè)置含有溶劑的細(xì)胞培養(yǎng)液的對照孔以排除此干擾。
4. 檢測時需使用適合于細(xì)胞培養(yǎng)的白色或黑色的多孔板 (96 孔板或 384 孔板)，普通透明多孔板的相鄰孔之間可能會產(chǎn)生相互干擾。如使用透明板，可使用不透明的白色膠帶粘貼孔底。
5. 建議在避光環(huán)境下進(jìn)行熒光檢測。
6. 由于整個發(fā)光反應(yīng)非常迅速，建議加入 CTG 試劑孵育 10 分鐘后，立即檢測熒光。

 

相關(guān)產(chǎn)品

Cell Counting Kit-8 Cell Counting Kit-8，簡稱 CCK-8 試劑盒或 CCK8 試劑盒，是一種基于 WST-8 而廣泛應(yīng)用于細(xì)胞活性和細(xì)胞毒性檢測的快速、高靈敏度試劑盒。

CTG Cell Viability Detection Reagent MCE CTG 發(fā)光法細(xì)胞活力檢測試劑盒基于高靈敏度生物發(fā)光檢測技術(shù)，通過對 ATP 進(jìn)行定量以測定培養(yǎng)物中活細(xì)胞數(shù)目及細(xì)胞活力。

Cytotoxicity LDH Assay Kit MCE LDH Assay Kit 是通過分析釋放到培養(yǎng)上清液中的 LDH 活性而測定細(xì)胞損傷的試劑盒。配合使用 CCK-8 (Cat.: No. HY-K0301) 可獲得死細(xì)胞、活細(xì)胞數(shù)據(jù)。

MCE 的所有產(chǎn)品僅用作科學(xué)研究或藥證申報，我們不為任何個人用途提供產(chǎn)品和服務(wù)
 

參考文獻(xiàn)

 
1. Juanjuan He, Jing Wang, et al. SIPL1, Regulated by MAZ, Promotes Tumor Progression and Predicts Poor Survival in Human Triple-Negative Breast Cancer. Front Oncol. 2021 Dec 17;11:766790.   
 
2. Yueyue Yang, Jiafei Lin, Susu Guo, et al. RRM2 protects against ferroptosis and is a tumor biomarker for liver cancer. Cancer Cell Int. 2020 Dec 7;20(1):587.
 
3. Dorjbal Dorjsuren, Richard T Eastman, et al. Chemoprotective antimalarials identified through quantitative high-throughput screening of Plasmodium blood and liver stage parasites.Sci Rep. 2021 Jan 22;11(1):2121. 

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